新疆库木塔格沙漠植物中特殊资源细菌的分离研究

努苏拉提·阿尔肯 米尔阿迪力 阿曼·依布拉音

【摘 要】自然界中存在着大量的微生物，然而大部分的微生物因为不可培养等原因而不为人知。库木塔格沙漠地区的自然条件极其恶劣，想必会存在着大量处于VBNC状态的细菌。本研究就是利用复苏促进因子Rpf来尽可能的复苏处于沙漠植物骆驼刺根部的VBNC状态菌，并采用最大可能数法进行功能菌群的富集、纯化与分离，得到SCTR1、SCTR4-14等一系列菌株，经16S rDNA基因测序和系统树分析得到所获菌株的种属等。

【关键词】骆驼刺；VBNC菌；Rpf；16s rDNA；系统树

一、前言

（一）研究背景

环境中90%以上的微生物处于VBNC状态。它们在受到外界压力刺激后，通过一系列类似分化的遗传程序而使自身处于一种能抵抗压力和饥饿的状态。多种研究表明处于VBNC状态的菌可能是由于对其生长繁殖条件的不了解，而无法利用现有的分离培养条件得到的微生物。再者可能是由于现有环境条件的改变而使其转变为非可培养状态，而无法分离培养得到的微生物。对于前者可经深入探索其适宜的生长繁殖条件，恢复其可培养状态，从而为开发新的微生物资源提供技术支持。对于后者当给予适宜的条件时可恢复生长繁殖，此适用于对潜在病原菌发病机理的研究及其预防。

新疆维吾尔自治区位于我国西北边陲，气候干燥地区。库木塔格沙漠中生长着各种各样的沙漠植物，而本实验研究的是木塔格沙漠中典型植物骆驼刺。骆驼刺的根系一般长达20米，耐旱性强的植物。

VBNC菌的一个重要特征就是复苏。细菌复苏促进因子Rpf是第一个被发现的原核生物自分泌生长因子，具有促进细菌休眠体复苏的作用。Rpf是世界上首次报道的对其自身及近缘处于VBNC状态下的高GC革兰氏阳性分支杆菌（Mycobacterium）等菌种具有复苏促进作用的成分，可以使处于休眠状态的细菌复活。

（二）研究的目的

本课题旨在利用复苏促进因子Rpf来处理库木塔格沙漠植物骆驼刺的根系中处于VBNC状态的菌种，使其重新恢复生长繁殖能力，从而获得特殊资源菌种。利用MPN法（最大可能数法）培养、纯化后所得到VBNC优势菌群，获得微生物多样性物种资源。并通过对未知菌株进行16S rDNA测序，对测序结果进行比较分析，将其进行分类与鉴定，初步确定该菌株的种属地位。

（三）研究的意义

通过对VBNC细菌复苏的相关研究，重新认识和评价微生物在食品发酵、农业、环保等领域的作用提供新的科学依据，赋予其更为广阔的开发应用前景。而新疆沙漠地区的土壤中有类此的菌，这些细菌的理化性质以及功能作用都还无从得知。这也就意味着，新疆沙漠地区的活的但不可培养的状态菌在经过复苏培养，认识到沙漠植物中的微生物多样性，以及开发应用打下基础。

二、研究技术原理

（一）MPN法（最大可能数法）

MPN是利用多个连续稀释度（一般采用十倍系列稀释），每个稀释度有多个平行发酵管进行试验，通过其结果的阳性管数分布情况（如0-0-0、2-0-0、3-1-0等），查MPN表从而得出报告结果的一种计数方式。每 个浓度稀释液接种的平行管数可以说3、5、10或者更多，平行样品的数量越多，精确度越高。

（二）16s rDNA测序技术

16s rDNA鉴定是指用利用细菌16s rDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16s rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤，应用有细菌种属鉴定。

（三）系统发育树构建

系统发育树是生物信息学中描述不同生物之间的相关关系的方法。在系统学分类的研究中，最常用的可视化表示进化关系的方法就是绘制系统发育进化树（Phylogenetic trees），用一种类似树状分支的图形来概括各种（类）生物之间的亲缘关系。

三、实验部分

（一）实验试剂和仪器

1.实验试剂

（1）库木塔格沙漠植物骆驼刺的根部

（2）培养基成分：

LMM培养基：NH4Cl、KH2PO4、MgSO4、CuSO4、MnCl2、FeSO4、Na2MoO4、ZnSO4、L乳酸锂盐生物素、L-蛋氨酸、维生素b1、肌苷。

LB培养基：蛋白胨，酵母粉，NaCl，琼脂。

（3）实验所用试剂：

（1）75%酒精：

（2）0.9%无菌生理盐水

（3）复苏促进因子Rpf

（4）1mol/L 盐酸溶液

（5）1mol/L 氢氧化钠溶液

（6）引物：8F、1510R

（7）mix

（8）核酸染料

（9）1×TAE缓冲溶液

（10）marker

（11）无菌Milli-Q水

2.实验内容

3.2.1实验前期准备

注：（所有操作洁净工作台上进行）

Rpf的制备：

（1）制备100ml LB培養液于锥形瓶，搅拌均匀。无菌状态下，将藤黄球菌接种于LB培养液中，置于摇床恒温培养12h（30℃，120r）。

（2）制备500ml LMM培养液，平均分装于两个锥形瓶中，灭菌。装置分配，后置于摇床恒温培养48h（30℃，120r）。

（3）将液体倒入14个50ml的离心管中离心，过滤2次，只留下RPF因子。将过滤后其中一个放入4°C冰箱保存。另一个进行灭菌，作为失活的Rpf。

3.2.2实验过程及相应的实验结果

注：（所有操作均在超净台中进行）

1.样品的处理：

将骆驼刺样品剪成碎片，进行研磨。灭菌的离心管中加入15 mL无菌水，配置菌悬液。下图1即为实验制备的菌悬液。

2.样品中VBNC菌的选择培养（MPN法）：

（1）配制液体LB培养基，灭菌后冷却备用；

（2）首先对骆驼刺溶液进行分梯度稀释，又分为实验组和对照组，在实验组中加入活性的Rpf，在对照组中加入失活的Rpf

（3）在30℃恒温培养箱中进行培养，观察，抽出相应的浓度梯度进行下一步的实验。

（4）按照实验结果，我们选择了10-2、10-5、10-7、10-9这4个梯度。

3.细菌的分离纯化培养：

（1）配制LB固体培养基，进行灭菌，倒平板，放置4℃冰箱冷藏保存；

（2）按上一步所选择的稀释度来进行涂布，进行倒置培养；

（3）从平板上，挑选出不同的菌株，用划线法接种到新的平板上。（菌落的图片详见附件2）

4.菌种的鉴定

我们对目标菌株的菌落形态进行观察记录，然后对目标菌株使用抽提试剂盒进行DNA抽提，用PCR扩增引物（27F和1510R）进行扩增，并使用吸附柱使PCR产物纯化。再经过琼脂糖凝胶电泳进行验证，验证完成后将所得的PCR纯化产物送往测序公司进行正反向测序，测得16S rDNA序列号后利用网络微生物鉴定资源信息比对近缘已知菌种，最后我们得到了每个菌株的近似菌种。

从上表1两种软件上的对比结果我们可以看到，SCTR4与SCTR5两株菌在NCBI和Ezicloub上的比对结果是一样的，我们可以将其近似认为是一株菌。并且我们可以发现现得到的菌株大部分为解淀粉芽孢杆菌类，除了这之外还有放线菌门下的考克氏菌属和变形菌门下代尔夫特菌（Betaproteobacteria；Burkholderiales；Comamonadaceae；Delftia）等。

5.构建优势菌种的16S rRNA基因系统树

（1）利用Contig Express基因拼接软件，修正实验所得优势菌种的16s rDNA序列。

（2）从数据库中下载与实验所得的优势菌种同属的模式菌的16s rDNA。

（3）将优势菌种的核苷酸序列与模式菌的核苷酸序列放在同一个Windows自带的记事本中，文件的第一行是由“>”+“菌株名及登陆序列号”组成，从第二行开始为序列本身，只允许使用既定的核苷酸或氨基酸编码符号。

（4）将记事本改为FASTA格式。利用软件MEGA6进行系统树的构建。

通过构建系统树我们可以很具体得看到这几种菌之间的亲缘关系的远近。SCTR1和SCTR14，SCTR4和5和6等都较为相近。（由于文章限制缩略了系统树图）

6.细菌的保存

（1）用接种环在固体斜面上划线，保存在4°C冰箱内。

实验过程中，我们一共分离出了12种菌。其中，8种来源于实验组（+Rpf），另外四种来源于对照组（-Rpf）.另外，这12种菌中，有十种为Bacillus属，另两种为特殊种.SCTR9与SCTR10这两种菌分属于Kocuria与Delftia 属，来源于实验组。可以说明Rpf复苏促进因子达到了对植物中VBNC状态菌起复苏和促进生长的作用。

本次研究的主要目的是利用复苏促进因子Rpf（resuscitation promoting factor）探索库木塔格沙漠土壤植物根系中处于VBNC状态的菌种，能重新恢复其生长繁殖能力，从而获得特殊资源菌种的方法。

通过系统树可以比较明确得判断出目标菌株的种属，根据近缘性，可以推测目标菌株的一些功能。总的来说，本次研究是比较成功的，运用新的分离方法和技术尽可能多的发掘微生物资源确定它们的分类地位、搞清系统进化关系，这无论在实际应用还是科学理论上都将产生积极而深远的影响。

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