亲和层析在蛋白质研究中的应用

董志萍

摘要：亲和层析是根据将相互间具有高度特异亲和性的两种物质之一作为固定相，利用生物分子与特定的固定配基之间的亲和力不同而使生物分子得以分离的层析方法。亲和层析已广泛应用于生物分子的分离和纯化，如酶、抗原、激素、糖蛋白及辅助因子以及细胞、细胞器等。特别是对于那些分离流程长、杂质多、使用常规方法难以分离的生物分子来说，亲和层析具有独特的优越性。本文主要介绍在生物因子、免疫几类常规亲和层析的原理及其在蛋白质的分离纯化以及分析鉴定方面的应用。

关键词：亲和层析；蛋白质；应用与发展

亲和层析是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基，使用亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂便进行选择吸附，它具有很高的选择和分离性能以及较大的载量，只需要简单操作即可使某待分离的生物大分子从复杂的混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持较高的活性，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。

1 亲和配基的选择与分类

亲和层析介质由配基和载体构成，配体是能与目的产物大分子相结合、解离的生物结构和分子，为决定亲和层析成功的关键因素。配体必须具有以下特征：与待分离的物质有适当的亲和力、与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性、与基质稳定的共价结合、自身应具有较好的稳定性。根据配体的特性并结合其与生物大分子之间相互作用体系的不同，亲和配基主要分为两大类。

1.1 特异性配体

特异性配体只与单一或很少种类的蛋白質等生物大分子结合的配体，能够分离特定单克隆抗体或多克隆抗体，如抗原和抗体、酶和它的抑制剂等。其中免疫亲和层析是利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统。免疫亲和层析应用十分广泛，许多典型的亲和层析纯化蛋白质的过程已经使用了单克隆抗体作为亲和配体。目前，利用抗体-抗原模式，有可能得到每一种目标蛋白的单抗，然后以单抗为配基，通过亲和层析技术分离纯化目标蛋白质。此种方法的纯化倍数、活性回收率非常高。免疫检测法利用被标记的抗体或模拟分析物来进行间接的分析。常用标记有荧光标记、酶标记、化学荧光等。脱氢酶和激酶等需要在辅酶存在的情况下才能表现出生物活性，即辅酶能与脱氢酶和激酶之间通过亲和作用相互结合，因此这些辅酶可用作脱氢酶和激酶的亲和配基。通常具有高的选择性，典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素-受体等。

1.2 通用性配体

一般通用性配体特异性不是很强，是能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如凝集素可以结合各种糖蛋白，凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合蛋白。它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖链结构的糖蛋白，可以有效地分离纯化不同型的凝集素，也可应用固定化的凝集素分离纯化各种糖蛋白。固定化金属离子亲和层析是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合。过度金属离子通过亚氨基二乙酸被固定在固定相载体表面，用作亲和吸附蛋白质的配基。

2 亲和层析的应用

2.1 亲和层析法分离纯化蛋白质

蛋白质组学中亲和层析主要被用作选择性地预处理和浓缩待处理样品，应用A蛋白亲和层析法，从采集的小鼠腹水中纯化抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体，能够得到纯度较高的单克隆抗体，适用于高纯度单克隆抗体的制备。另外，亲和层析也可浓缩蛋白，将所有蛋白分类成多个组群以便进一步分析鉴定。

在对样品分析鉴定前，可借助亲和层析进行预处理，减轻样品的复杂程度。同时亲和层析能被用在蛋白水解消化之前或之后的蛋白以及肽链的分离。亲和层析分析糖蛋白是利用目标聚糖甚至在蛋白质水解以后都能被凝集素识别而进行的，利用抗体和某些IMAC的亲和层析可用来分离并浓缩糖肽。

2.2 亲和色谱纯化生长因子

亲和层析也被用来研究生长因子间的相互作用如如初分离纯化舟山眼镜蛇毒，获得的蛇毒粗毒进行分子筛色谱，对含NGF部分进行离子交换色谱，分步洗脱。用0.02mol/L pH7.0 PBS平衡亲和色谱柱，取2g舟山眼镜蛇毒，用同样缓冲液溶解，离心去除沉淀，缓慢加样，然后用PBS洗去杂蛋白。亲和色谱纯化舟山眼镜蛇毒的洗脱曲线中，分隔带明显，亲和色谱分离NGF得率比传统分离方法提高将近50%。

2.4 亲和层析与其他分析技术相结合

生物分子的分离纯化，有时需要多种分离手段同时使用，在进行重组蛋白的纯化时，综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用、应首先选择能除去含量最多杂质的方法、应尽量选择高效的分离方法、应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段。近年来的另一发展趋势是寻求更加优化的系统设计和安排形式，从而获得快速、优良的选择性以及很大数量被检测的样品。亲和层析与其他分析技术串联结合即可很好地达到这一目的，色谱技术是目前所知的最好的分离方法之一，而亲和层析在其中也发挥着不可替代的作用，相信其在未来的发展也必将大有可为。

参考文献：

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