表皮生长因子对脂多糖刺激断奶仔猪肠道钠磷转运载体蛋白Ⅱb表达的影响

汤小朋 徐 荣 李成良 彭 鹏 禹琪芳 方热军

(湖南农业大学动物科学技术学院，湖南畜禽安全生产协同创新中心，长沙410128)

磷(P)是生物系统的重要组成部分，涉及到各种生理过程，包括能量代谢、细胞信号、核苷酸和磷脂生物合成以及牙齿、骨骼形成[1-2]。研究已证实钠磷转运载体蛋白Ⅱb(type Ⅱb sodium-phosphate cotransporter, NaPi-Ⅱb)是介导肠道磷主动转运的主要途径[3-4]。NaPi-Ⅱb受许多因素的调节，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是调节其表达的重要因素之一[5-8]。EGF是一种重要的生长因子，广泛存在于乳液、唾液、尿液、肠液、血液、羊水等体液中，对细胞生存、增殖与分化、迁移、凋亡等具有重要作用[9-11]。前人在人Caco2细胞及猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中的研究表明，EGF可抑制细胞NaPi-Ⅱb的表达，说明在正常培养条件下，EGF可能通过其他途径调节细胞对磷的吸收。理论上讲，在EGF对肠道屏障功能的修复过程中，必然伴随大量DNA、RNA和蛋白质的合成，其前提需要经肠道吸收更多的磷，此过程中所需更多的磷是通过何种途径满足机体需要还未见报道。因此，本研究通过细胞试验与动物试验相结合的方法，研究EGF对脂多糖(LPS)刺激的应激状态下断奶仔猪小肠磷吸收的影响，为进一步诠释EGF对磷的吸收提供新的认识。

1 材料与方法

1.1 细胞试验

1.1.1 主要试剂

EGF购自Peprotech公司；LPS、Tris、十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、吐温-20(Tween-20)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、丽春红购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青链双抗购自Gibco公司；DMEM/F12(HyClon)培养基购自GE公司；CCK-8试剂盒、BCA蛋白试剂盒、磷酸缓冲液(PBS)、RIPA蛋白裂解液购自索莱宝公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒、UltraSYBR Mixture及DM 2000 Plus DNA Marker均购自北京康维世纪公司；Super ECL Plus超敏发光液购自Thermo公司；一抗NaPi-Ⅱb(货号：21773-1-AP)、一抗β-肌动蛋白(β-actin)(货号：60008-1-Ig)、二抗(Goat Anti-Rabbit IgG/HRP)购自Proteintech公司。

1.1.2 细胞培养及分组

IPEC-J2细胞由中国科学院亚热带农业生态研究所提供。细胞经活化后，培养在含10% FBS、1%青链双抗的培养基中，置于37 ℃，含有5% CO2的培养箱中培养。细胞生长至80%～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，显微镜下计数，收集的细胞用于细胞传代或进行后续试验。试验设4个组：对照组(0 ng/mL EGF，0 μg/mL LPS)、EGF组(100 ng/ mL EGF，0 μg/mL LPS)、LPS组(0 ng/mL EGF，1.0 μg/mL LPS)、EGF+LPS组(100 ng/mL EGF，1.0 μg/mL LPS)，每组3个重复。EGF、LPS剂量的选择及培养时间的确定参照文献[11]。将细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，每孔加入2 mL含10% FBS、1%青链双抗的培养基，培养24 h后，弃去培养基，用37 ℃ PBS润洗2遍，然后分别加入相应剂量的EGF与LPS，加入培养基至2 mL，培养24 h。

1.1.3 EGF对LPS刺激的IPEC-J2细胞NaPi-ⅡbmRNA表达的测定

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞NaPi-ⅡbmRNA的表达。细胞培养结束后，用PBS洗涤细胞2次，每孔加入Trizol 1 mL，按照Trizol试剂说明书提取总RNA，并测定总RNA浓度及1%琼脂凝胶检测RNA完整性。以细胞总RNA为模板，用逆转录试剂盒反转录为cDNA，具体步骤参照试剂盒说明书。定量PCR反应按照荧光定量PCR检测试剂盒操作。所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。NaPi-Ⅱb引物序列为F：GCCCGAGCTTAAGAACACA，R：CATGACACCAGCACCATCGTT；β-actin引物序列为F：CATCCTGCGTCTGGACCTGG，R：TAATGTCACGCACGATTTCC。实时荧光定量PCR程序参照Tang[11]介绍的方法进行。以β-actin基因为内参，采用2-△△Ct法进行目的基因相对表达量计算。

1.1.4 EGF对LPS刺激的IPEC-J2细胞NaPi-Ⅱb蛋白表达的测定

采用Western blot检测细胞NaPi-Ⅱb蛋白的表达。细胞培养结束后，弃去培养基，PBS洗涤细胞1次，加入250 μL RIPA细胞裂解液(含1 mmol/L蛋白酶抑制剂)，冰上裂解15 min，4 ℃，12 000 r/min离心3～5 min，取上清分装后置于-80 ℃冰箱保存，待测。蛋白浓度测定采用南京建成的BCA蛋白浓度检测试剂盒测定，具体参照说明书步骤进行。Western blot程序参照Tang等[11]介绍的方法进行。

1.2 动物试验

1.2.1 试验材料

EGF由长沙某公司提供，EGF含量为4 000 mg/kg；LPS(大肠杆菌血清型O55∶B5)、石蜡、中性树胶、伊红购自Sigma公司；RT-PCR所需试剂同1.1.3。

1.2.2 试验动物及分组

选取24头体重接近、健康状况良好的21日龄“长白×大白”二元杂交断奶阉公猪[平均体重(5.76±0.38) kg]，随机分为4个组：对照组(基础饲粮)、EGF组(基础饲粮+2 mg/kg EGF)、LPS组(基础饲粮+腹腔注射100 μg/kg BW LPS)、EGF+LPS组(基础饲粮+2 mg/kg EGF+腹腔注射100 μg/kg BW LPS)，每组6个重复，每个重复1头猪，试验期14 d。基础饲粮配制参照NRC(2012)猪的营养需要，其组成及营养水平见表1。在试验的第8天、第15天清晨，给LPS组和EGF+LPS组仔猪注射100 μg/kg BW的LPS[12]，对照组和EGF组注射等量的生理盐水。

表1 基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础)

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet：VA 10 000 IU,VD31 500 IU,VE 60 mg,VK33 mg,VB11.8 mg,VB120.024 mg,核黄素riboflavin 6 mg,叶酸 folic acid 0.3 mg,生物素 biotin 4.5 mg,烟酸 nicotinic acid 24 mg,D-泛酸D-pantothenic acid 15 mg,胆碱 choline 1 000 mg,Zn 125 mg,Fe 120 mg,Cu 150 mg,I 0.3 mg,Se 0.3 mg。

2)粗蛋白质、总磷、钙为实测值，其余为计算值。CP, total P, Ca were measured values, while others were calculated values.

1.2.3 饲养管理

本试验于2017年11月12日至2017年11月29日在益阳兆丰农牧科技有限公司猪舍进行。试猪单栏饲养，试验期间自由采食与饮水。每天08:00、12:00、16:00、20:00投喂饲粮，第2天投喂前收集剩余饲粮。每天中午通风15 min左右，猪舍温度控制在25～28 ℃，相对湿度50%～70%。

1.2.4 样品采集

血样：试猪在试验的第15天，注射LPS 6 h后，采集前腔静脉血10 mL。血液样品在4 ℃，3 500 r/min离心10 min，收集血清，-20 ℃保存。

黏膜样：试猪在试验的第15天，注射LPS 6 h后，全部仔猪注射50 mg/kg BW的戊巴比妥钠，待完全麻醉后屠宰，屠宰后迅速从胸骨到耻骨切线打开腹腔，取出胃肠道，于空肠、回肠处分别采集约5 cm肠段，用4 ℃预冷1×PBS轻轻漂洗，于冰面上刮取黏膜，分装2管，液氮速冻后于-80 ℃保存。

1.2.5 EGF对LPS刺激的断奶仔猪血清钙、磷含量的测定

血清钙含量的测定采用南京建成生物工程研究所生产的钙测试盒(微板法，货号C004-2)测定。血清磷含量的测定采用南京建成生物工程研究所生产的磷测试盒(磷钼酸法，货号C006)。测定步骤参照相应的试剂盒说明书进行。

1.2.6 EGF对LPS刺激的断奶仔猪血清碱性磷酸酶(ALP)活性的测定

血清ALP活性采用迈瑞全自动生化分析仪(BS-200,深圳迈瑞医疗电子股份有限公司)检测。试剂盒购自深圳迈瑞公司，测定步骤参照说明书进行。

1.2.7 肠黏膜NaPi-ⅡbmRNA表达的测定

采用qRT-PCR法测定空肠、回肠肠黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表达情况。具体操作同1.1.3。

1.3 统计分析

试验结果以“平均值±标准差”(means±SD)表示，采用SPSS 21.0统计软件的一般线性模型(GLM)进行两因素方差分析，模型主效应包括EGF处理、LPS处理以及两者的互作，one-way ANOVA程序进行单因素方差分析，组间差异采用Duncan氏法进行多重比较，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 EGF对LPS刺激的IPEC-J2细胞NaPi-Ⅱb mRNA表达的影响

由图1可知，与对照组相比，EGF组细胞NaPi-ⅡbmRNA表达显著下降(P<0.05)，EGF+LPS组细胞NaPi-ⅡbmRNA表达显著提高(P<0.05)。与EGF组相比，EGF+LPS组细胞NaPi-ⅡbmRNA表达显著提高(P<0.05)。与LPS组相比，EGF+LPS组细胞NaPi-ⅡbmRNA表达显著提高(P<0.05)。EGF与LPS免疫应激的互作效应对NaPi-ⅡbmRNA表达影响显著(P<0.05)。结果表明，EGF抑制细胞NaPi-ⅡbmRNA的表达，但在应激状态下EGF促进细胞NaPi-ⅡbmRNA的表达。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，图2、图3同。

Values with different small letters mean significant difference (P<0.05), while with the same letter mean no significant difference (P>0.05). The same as Fig.2 and Fig.3.

图1EGF对LPS刺激的IPEC-J2细胞NaPi-ⅡbmRNA表达的影响

Fig.1 Effects of EGF onNaPi-ⅡbmRNA expression in IPEC-J2 cells challenged by LPS

2.2 EGF对LPS刺激的IPEC-J2细胞NaPi-Ⅱb蛋白表达的影响

由图2可知，与对照组相比，EGF组细胞NaPi-Ⅱb蛋白表达显著下降(P<0.05)，EGF+LPS组细胞NaPi-Ⅱb蛋白表达显著提高(P<0.05)。与EGF组相比，EGF+LPS组细胞NaPi-Ⅱb蛋白表达显著提高(P<0.05)。与LPS组相比，EGF+LPS组细胞NaPi-Ⅱb蛋白表达显著提高(P<0.05)。EGF与LPS免疫应激的互作效应对NaPi-Ⅱb蛋白表达影响显著(P<0.05)。Western blot结果同样表明，EGF抑制细胞NaPi-Ⅱb蛋白表达，但在应激状态下EGF促进细胞NaPi-Ⅱb蛋白的表达。

2.3 EGF对LPS刺激的断奶仔猪血清钙、磷含量和ALP活性的影响

由表2可知，各组间血清钙含量无显著差异(P>0.05)；EGF与LPS免疫应激互作效应对血清钙含量无显著影响(P>0.05)。LPS组血清磷含量显著高于对照组、EGF组、EGF+LPS组(P<0.05)，且EGF与LPS免疫应激互作效应对血清磷含量影响显著(P<0.05)；EGF组血清ALP活性显著高于LPS组(P<0.05)，与对照组、EGF+LPS组差异不显著(P>0.05)，EGF与LPS免疫应激互作效应对血清ALP活性无显著影响(P>0.05)。

2.4 EGF对LPS刺激的断奶仔猪小肠黏膜NaPi-Ⅱb mRNA表达的影响

由图3可知，与对照组相比，EGF组空肠(图3-A)、回肠(图3-B)黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表达均显著降低(P<0.05)，EGF+LPS组空肠(图3-A)、回肠(图3-B)黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表达均显著增加(P<0.05)。与LPS组相比，EGF组空肠(图3-A)、回肠(图3-B)黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表达均显著降低(P<0.05)，EGF+LPS组空肠(图3-A)、回肠(图3-B)黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表达均显著增加(P<0.05)。与EGF组相比，EGF+LPS组空肠(图3-A)、回肠(图3-B)黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表达均显著增加(P<0.05)。EGF与LPS免疫应激互作效应对空肠与回肠NaPi-ⅡbmRNA的表达影响显著(P<0.05)。动物试验结果表明，EGF抑制小肠黏膜NaPi-ⅡbmRNA表达，但在应激状态下促进小肠黏膜NaPi-ⅡbmRNA表达。

3 讨 论

磷是动物必需的矿物质元素之一，在动物生长发育、骨骼形成、能量代谢、核酸合成、细胞信号转导以及维持血液酸碱平衡中起着重要作用[1,3,13]。血清碱性磷酸酶是反映动物机体钙磷代谢状况的血清生化指标，当机体缺乏钙磷时，碱性磷酸酶释放增加。本研究结果表明，EGF对LPS刺激的仔猪血清钙含量无显著影响，但对血清磷含量影响显著。EGF组血清ALP活性显著高于LPS组，但饲粮EGF与LPS免疫应激互作效应对血清碱性磷酸酶活性无显著影响。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁破裂后释放的毒性物质，是导致急性肾损伤的主要因素之一[14]。本研究中LPS组血清磷含量显著高于其他组，可能是LPS刺激导致了仔猪肾脏功能损伤，影响肾脏对磷的重吸收，从而导致血清磷含量异常升高。

A: Western blot电泳图；B：NaPi-Ⅱb蛋白表达量。

A: Western blot electrophoretogram; B: NaPi-Ⅱb protein expression level.

图2 EGF对LPS诱导的IPEC-J2细胞NaPi-Ⅱb蛋白表达影响

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。

Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

A：空肠NaPi-ⅡbmRNA相对表达量；B：回肠NaPi-ⅡbmRNA相对表达量。

A:NaPi-ⅡbmRNA relative expression level in the jejunum; B:NaPi-ⅡbmRNA relative expression level in the ileum.

图3EGF对LPS刺激的断奶仔猪小肠黏膜NaPi-ⅡbmRNA表达影响

Fig.3 Effects of EGF onNaPi-ⅡbmRNA expression in the small intestinal mucosa of weaned piglets challenged by LPS

肠道磷的吸收主要有被动扩散和主动吸收2种方式，NaPi-Ⅱb是调节肠道磷主动转运的主要载体[3-5]，介导机体70%～90%磷的主动转运[15-16]。NaPi-Ⅱb的调控受许多因素的影响，如磷[1]、维生素D3[17]、雌二醇[2]、神经肽Y[4]、降钙素基因相关肽、EGF[5-8]等。EGF是一种含有53个氨基酸残基的小肽，其生物学功能的发挥是通过与其表皮生长因子受体(EGFR)结合后实现的[9]。EGFR广泛存在于小肠刷状缘顶端及基底侧，当动物摄取的EGF递送到小肠黏膜后与EGFR结合，形成二聚物，激活酪氨酸激酶(RTK)活性，促进RTK自我磷酸化，随后激活Ras/丝裂原活化蛋白激酶(Ras/MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、磷脂酶C-γ/蛋白激酶C(PLC-γ/PKC)等一系列的信号通路，对细胞生存、增殖与分化、迁移、凋亡等具有重要作用[9-11,18]。前人在人Caco2细胞中的研究表明，EGF通过修饰c-myb蛋白，经蛋白激酶C/蛋白激酶A(PKC/PKA)和MAPK信号通路调节下游启动子功能，从而抑制细胞NaPi-Ⅱb的转录活性，降低其表达量[5-6]。本课题组在猪IPEC-J2细胞中同样发现EGF抑制了细胞中NaPi-Ⅱb的表达，进一步研究发现EGF作用NaPi-Ⅱb启动子区域位于-1 092～-1 085 bp区域(5′-TCCAGTTG-3′)，且EGF通过激活EGFR、PKA、PKC、P38、细胞外信号调节激酶(ERK)、氨基末端激酶(JNK)等信号分子来下调IPEC-J2细胞中NaPi-Ⅱb的表达[7-8]。Tang等[11]研究表明，一定浓度的EGF可促进IPEC-J2细胞增殖，而细胞增殖过程中需要大量的磷用来合成RNA及DNA，说明EGF可促进磷的吸收，但不是通过NaPi-Ⅱb介导的磷的主动吸收，可能存在其他途径介导磷的吸收。

应激是动物生产过程中的普遍现象，可导致动物肠道损伤，影响生产成绩。LPS对小肠上皮细胞具有毒害作用，能刺激猪小肠上皮细胞分泌大量白介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促炎细胞因子，最终导致炎症的发生[19-21]。Tang等[11]研究表明，LPS刺激诱导了细胞氧化应激及细胞凋亡的发生，而EGF可通过缓解氧化应激减少细胞凋亡来保护LPS刺激的肠上皮细胞损伤。理论上讲，在EGF对受损肠细胞修复过程中，必然伴随大量DNA、RNA和蛋白质的合成，其前提需要经肠道吸收更多的磷，此过程中EGF是否解除对NaPi-Ⅱb表达的抑制作用，从而促进磷的主动吸收，以满足机体对磷的需要，还未见报道。因此，本研究采用细胞试验与动物试验相结合的方法研究EGF对应激状态下(LPS刺激)猪小肠磷吸收的影响，结果表明，EGF抑制IPEC-J2细胞的NaPi-ⅡbmRNA及蛋白的表达，抑制仔猪空肠与回肠黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表达，这与Xu等[4-5]、Xing等[6]、邢廷杰等[7]研究结果一致，而EGF可促进LPS刺激的IPEC-J2细胞NaPi-ⅡbmRNA及蛋白的表达，促进LPS刺激的断奶仔猪空肠与回肠黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表达，说明在非应激状态下EGF抑制NaPi-Ⅱb介导的磷的主动转运，在应激状态下，EGF可解除对NaPi-Ⅱb的抑制，调控NaPi-Ⅱb介导的磷的主动吸收，以满足机体对磷的需要，加快肠道修复进程。前人研究表明，EGF对断奶仔猪的生长及肠道发育具有促进作用[22-23]，说明EGF是促进磷吸收，但不是通过NaPi-Ⅱb介导的磷的主动吸收。机体磷稳态的维持是通过肠道磷吸收与肾脏磷重吸收实现的[24]。肠道磷吸收有被动扩散和主动转运，除了NaPi-Ⅱb介导的主动转运，Ⅲ型钠离子依赖转运载体蛋白(type Ⅲ transporters PiT1 and PiT2)也能介导部分磷的主动吸收[25]，肾脏重吸收主要由NaPi-Ⅱa与NaPi-Ⅱc 2种蛋白介导，当肠道磷吸收不足时，肾脏磷重吸收加强，从而满足机体磷的需要[26]。因此，本研究中EGF可能通过增强肠道磷的被动扩散吸收，或通过增强PiT1和PiT2介导的磷主动转运，或通过加强肾脏重吸收满足机体磷的需要，但具体通过何种途径调节磷的吸收还需进一步的研究。应激条件下EGF如何解除对NaPi-Ⅱb的抑制，从而介导磷的主动转运以满足机体需求还需进一步的研究。

4 结 论

EGF对肠道NaPi-Ⅱb的表达起抑制作用，但在免疫应激状态下可促进NaPi-Ⅱb的表达。