24-油菜素内酯溶液浸泡处理对鲜切生菜褐变的影响

乔永祥，谢晶，雷昊

(上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台，食品科学与工程国家级实验教学示范中心(上海海洋大学)，上海海洋大学 食品学院，上海,201306)

生菜又称叶用莴苣，是一种营养丰富绿色健康的绿叶蔬菜，由于生菜中富含维生素、碳水化合物和矿物质等营养物质，常作为蔬菜沙拉食用[1-2]。生菜经过切割等处理加速了生理劣变，贮藏过程的酶促褐变是最常见的问题之一，严重影响鲜切产品的感官品质[3]。目前对于抑制褐变的物理化学方法有很多，抗坏血酸、胱氨酸、柠檬酸、草酸和1-甲基环丙烯等化学试剂[4]已被前人证明可以很好地抑制酶促褐变，然而这些化学防褐变方法提高了产品成本并且效率低[2]；热处理、辐射等物理处理虽然对抑制褐变也有一定的效果，但这些物理处理方式损害了产品的感官特性和营养价值[5]。因此急需一种新的抑制褐变的方法替代原有的方法。

油菜素内酯(24-epibrassinolide，EBR)是一种由植物多羟基构成的，并被确认为一种新的天然无毒无害植物激素，在植物生长发育中起着至关重要的作用的物质，其存在于多种植物的器官中，参与很多生理和生化过程，是调节各种生理过程必不可少的物质[6]。有研究表明适当浓度的外源油菜素内酯处理还能有效缓解各种生物、非生物胁迫对植物造成的氧化损伤[7]，有效地维持采后果蔬的品质质量。ZHU等[8]将枣果在5 μmol/L油菜素内酯溶液中浸泡5 min可以很好地抑制青霉病，维持良好的外观；GAO等[9]研究发现茄子经过油菜素内酯浸泡10 min可以很好地降低多酚氧化酶、过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶等活性，从而在贮藏期间抑制茄子果肉的褐变，延长货架期；同时GAO等[10]以鲜切藕片为试验对象，研究发现用80 nmol/L的油菜素内酯溶液浸泡10 min可以有效地抑制酚类代谢和与褐变相关酶活性如多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等，从而降低鲜切藕片表面褐变。

目前还没有人将油菜素内酯用于抑制鲜切生菜的褐变。因此本试验主要以鲜切生菜为研究对象，探讨在贮藏过程中外源油菜素内酯处理对鲜切生菜褐变的影响，通过研究其对感官品质、褐变指数以及褐变相关酶的酶活性的影响，从而更好地理解油菜素内酯在抗褐变中的作用，并提供一种鲜切生菜保持品质质量和延长保质期的新工艺。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜生菜：购自上海市浦东新区临港新城某菜市场，挑选颜色鲜亮、脆嫩、无腐烂虫害、大小一致的生菜为试验原料。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机(H-2050R-1型)，长沙湘仪离心机有限公司；冰箱(BCD-252MHV型)，苏州三星电子有限公司；紫外可见分光光度计(WFZ UV-2100)，上海龙尼柯仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 生菜预处理

将新鲜购买的生菜及时进行处理，挑选光鲜饱满、大小均匀、无虫害无缺损的生菜，将其切成3～5 cm小段，分别于自来水、5 μmol/L EBR、15 μmol/L EBR溶液(根据预实验的研究结果确定)中浸泡10 min，记为CK、A、B组，捞出在通风阴凉处沥干1 h。本试验选取鲜切生菜叶脉[11]为研究对象，将浸泡好的鲜切生菜叶脉盛放在塑料托盘中，每个托盘80 g左右，并用保鲜膜封口，贮藏在(4±1) ℃冰箱中，每组大约准备8～10盒，以备后续指标测定。每次实验每组样品随机选择3盒，测量其褐变指数、多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、脂氧合酶活性、丙二醛含量以及感官品质评分。

1.3.2 感官质量评价

参照KING等[12]的方法，并稍加修改：每次邀请3名经过培训具有一定蔬菜感官评价经验的叶菜感官评价员组成评定小组，采用数字化评分方法(1～9分)对各试验结果进行判别打分：9分为色泽鲜艳，质地脆嫩，切口无褐变；7分为色泽较鲜艳，切口出现轻微褐变；5分为货架期终点，表现为色泽黯淡，切口褐变面积扩大；3分为切口褐变严重，叶片萎蔫，有异味；1分为严重腐烂，有异味。

1.3.3 褐变指数的测定

参考KIM等[13]略有修改，取2个生菜叶片组织，将其浸入40 mL蒸馏水和10 mL 10%三氯乙酸的混合溶液，室温放置2 h后进行过滤。以蒸馏水作为对照，在420 nm波长下用紫外分光光度计测量滤液的吸光度。

1.3.4 多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)活性测定

参照ZHAN等[14]测定方法在480 nm处测定其吸光度。

1.3.5 过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性测定

参照ZHOU等[15]测定方法在420 nm处测定其吸光度。

1.3.6 苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL)活性测定

在290 nm处测定其吸光度[16]。

1.3.7 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的测定

分别在450、532和600 nm测定其吸光度[17]。

1.3.8 数据处理与统计分析

各指标均做3次平行，均采用Microsoft Excel 2013软件进行数据整理，试验结果以“平均值±标准差”表示；用Origin 8.6软件绘图，应用SPSS Statistics 19.0进行差异显著分析(p<0.05为差异显著 )。

2 结果与分析

2.1 鲜切生菜感官品质的变化

由图1可知，随着贮藏时间的延长，各处理组的样品感官评分逐渐降低，其中对照组样品感官品质衰败的最快，贮藏第3天，鲜切生菜在切口处出现轻微褐变，在第6天，切口处的褐变面积扩大，鲜切生菜叶片略微变黄萎蔫，在第9天，鲜切生菜切口褐变严重，叶片萎蔫，已有腐烂迹象，失去食用价值，这是可能是因为生菜经切割处理后造成组织结构破坏，导致乙烯产生，从而引起一系列的生理变化如菜叶褐变、黄化[18]。处理组B与对照组差异显著(p<0.05)，在贮藏第9天，感官评评分为8.3，叶片柔嫩鲜绿，切口处表现出轻微褐变，在第12天，感官品质急剧下降，切口褐变严重，褐变面积增大，叶片萎蔫黄化，失去食用价值。SERNA等[19]研究发现香蕉果皮叶绿素降解相关的过氧化物酶活性异常高是香蕉果皮褐变的原因之一，因此推断这可能是由于EBR处理抑制了其过氧化物酶活性，提高了鲜切生菜的抗逆性，从而保护了鲜切生菜鲜亮的色泽，使其保持良好的感官品质[20]。由此可见一定浓度的EBR处理可以保护鲜切生菜良好的外观，抑制切口的褐变速度。

图1 油菜素内酯对鲜切生菜感官品质的影响Fig.1 Effects of 24-epibrassinolide on sensory quality of fresh-cut lettuce

2.2 鲜切生菜褐变指数的变化

褐变指数通常被认为是一种间接的度量指标，用来反映由褐变反应生成的可溶性色素化合物含量，从而反映果蔬褐变程度[13]。贮藏期间鲜切生菜褐变指数的变化情况如图2所示，由图2可以看出随着贮藏时间的增加，各处理组褐变指数呈上升趋势，其中对照组褐变指数急剧上升，对照组CK和处理组A之间差异不显著(p>0.05)，第6天处理组B与处理组A差异显著(p<0.05)。在贮藏前期处理组B的褐变指数变化幅度不大，在第9天褐变指数为0.022，而CK组为0.042，贮藏末期褐变指数为0.064仍处于较低水平，而CK组为0.091，这可能是由于油菜素内酯附着在切口表面在一定程度上隔绝了环境中的氧气，从而抑制了褐变的产生[21]，因此一定浓度的油菜素内酯溶液可以抑制鲜切生菜切口褐变，维持鲜切生菜鲜亮的外观。

图2 油菜素内酯对鲜切生菜褐变指数的影响Fig.2 Effects of 24-epibrassinolide on browning index of fresh-cut lettuce

2.3 鲜切生菜多酚氧化酶活性的变化

多酚氧化酶(PPO)是导致酶促褐变的主要酶，组织内的酚类物质被氧化为醌，形成褐色色素，参与褐变反应[22]，一般多酚氧化酶活性越高，褐变程度越大，因此PPO活性可以作为衡量预测褐变敏感性的一个指标。

图3 油菜素内酯对鲜切生菜多酚氧化酶活性的影响Fig.3 Effects of 24-epibrassinolide on polyphenol oxidase activity of fresh-cut lettuce

由图3可以看出，各处理组均表现出先上升后下降的趋势，其中各处理差异显著(p<0.05)，对照组CK在贮藏前期PPO活性急剧上升，最高为30.14 U/g，这可能是因为鲜切处理造成生菜细胞组织被破坏，增大了与氧气接触的面积，加速褐变反应速度，在贮藏第12天，PPO活性迅速下降，这可能是由于随着贮藏时间的延长，酶促反应的底物不断减少，导致酶活性降低[23]。贮藏末期CK组的PPO活性为16.98 U/g，比处理组B高32%，这是因为经过油菜素内酯处理减少了切口表面多酚氧化酶和酚类物质的接触，抑制了酶促褐变反应的进行[10]。处理组A对于PPO活性的抑制效果不如B组，可能是因为油菜素内酯溶液浓度过低。

2.4 鲜切生菜过氧化物酶活性的变化

植物体内的过氧化物酶(POD)是以单或双酚类化合物为底物合成的[2]，而酶促褐变的重要底物是酚类物质，有研究表明在植物组织中，POD通常协同PPO引起鲜切果蔬的酶促褐变[24]，因此POD活性也是衡量褐变的一个重要指标。图4为贮藏期间鲜切生菜POD活性的变化情况，由图4可以看出，随着贮藏时间的延长POD活性呈现出先上升后下降的趋势，其中各处理组表现出差异性(p<0.05)，油菜素内酯处理显著提高了POD活性，在贮藏末期处理B组的POD活性为15.88 U/g，是对照组的1.09倍，这可能是因为油菜素内酯处理可以增加 WRKY30 转录因子和防御相关基因的转录水平，从而导致POD活性显著提高，清除细胞内的活性氧的能力增强，避免了活性氧的积累，从而达到抑制褐变的目的[25]。这与GAO和唐如雪等[10,20]研究的油菜素内酯处理提高了POD活性结果相一致。

图4 油菜素内酯对鲜切生菜过氧化物酶活性的影响Fig.4 Effects of 24-epibrassinolide on peroxidase activity of fresh-cut lettuce

2.5 鲜切生菜苯丙氨酸解氨酶活性的变化

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是酚类物质合成的主要酶类之一，在一定程度上由于酚类化合物的积累，导致PAL活性增加，促进鲜切果蔬褐变反应的进行，因此PAL活性与鲜切果蔬褐变有着密切的关系。由图5可以看出，对照组CK在贮藏前期PAL活性急剧上升，在第6天达到2.28 U/g，随着贮藏时间的延长PAL活性逐渐开始下降，而处理组B在整个贮藏过程中PAL活性变化不大，与CK组差异显著(p<0.05)，在贮藏末期PAL活性为1.22 U/g，比CK组低30%，这可能是因为经过油菜素内酯处理使其组织内产生的过氧化氢量减少，从而抑制了PAL的活性[9]。该结果与李丽花等[26]研究的油菜素内酯处理可以显著提高杏果实中PAL活性的结果想类似，这说明油菜素内酯处理对鲜切生菜组织的褐变具有保护作用。

图5 油菜素内酯对鲜切生菜苯丙氨酸解氨酶活性的影响Fig.5 Effects of 24-epibrassinolide on penylalanine ammonia lyase activity of fresh-cut lettuce

2.6 鲜切生菜丙二醛含量的变化

鲜切果蔬经过鲜切处理使切口组织的膜受到损伤，加快膜脂过氧化反应，从而促进褐变的进行，丙二醛作为膜脂过氧化作用的产物之一，能用来衡量和评价蔬菜膜系统受伤害的程度。由图6可以看出，在贮藏期间各处理鲜切生菜的丙二醛含量呈上升趋势，其中对照组上升趋势尤为显著，处理组A和对照组CK差异不显著(p>0.05)，这可能是因为切割处理对生菜造成损害胁迫[27]，而处理组A的油菜素内酯浓度过低，不能对鲜切生菜的切口起到保护作用，从而使丙二醛含量没有表现出明显变化；处理组A和处理组B从第6天开始表现出差异性(p<0.05)，在贮藏末期处理组B丙二醛含量仍处于较低水平，比对照组少了28.57%，这是因为油菜素内酯处理可以调节植物组织内抗氧化酶的活性，维持细胞内外离子平衡，降低膜脂过氧化物MDA的产生[28]。这与WU等[29]研究的油菜素内酯处理可以抑制茄子中丙二醛含量的增加结果相一致。因此一定浓度的油菜素内酯溶液可以延缓鲜切生菜丙二醛含量的积累，减少细胞组织的破裂，避免褐变发生。

图6 油菜素内酯对鲜切生菜丙二醛含量的影响Fig.6 Effects of 24-epibrassinolide on MDA content of fresh-cut lettuce

3 结论

鲜切生菜经过鲜切处理后，一方面造成机械损伤，增强膜脂质过氧化，促使丙二醛的含量积累增加，细胞破裂，氧气与酚类物质接触，加速褐变；另一方面鲜切可以诱导苯丙氨酸解氨酶活性，也与褐变有一定的因果关系[13]。本试验以油菜素内酯浸泡10 min的鲜切生菜为试验材料，以自来水清洗为对照组，研究贮藏期间油菜素内酯对鲜切生菜褐变的影响。结论如下：

在贮藏期间，对照组中鲜切生菜在第9天，切口褐变严重，叶片萎蔫，已有腐烂迹象，失去食用价值，而油菜素内酯处理效果明显优于对照组，其中用15 μmol/L油菜素内酯处理鲜切生菜效果尤为显著，在贮藏期间可以很好地抑制多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，提高过氧化物酶的活性，延缓了丙二醛含量的积累，抑制了鲜切生菜褐变的发生，在第12天才失去食用价值，因此采用适宜浓度的油菜素内酯可以很好地抑制鲜切生菜的褐变，为今后研究鲜切生菜的保鲜和延长货架期提供了一种新的尝试和方向。