乙醇熏蒸对双孢蘑菇的护色作用

靳苗苗，李云云，张洪翠，张敏

(西南大学 食品科学学院，农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(重庆)，重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆,400715)

双孢蘑菇(Agaricusbisporus)因其营养丰富、具备一定药用价值且栽培成本低，总产量居世界食用菌之最[1]；据统计，中国2013年双孢蘑菇产量高达237万t，产量居全球榜首[2]。然而，双孢蘑菇呼吸作用极强、生理代谢旺盛，表面无角质层保护、含水量高，极易产生褐变、受到微生物侵染[3]，常温下货架期仅1～3 d[4]。白度是双孢蘑菇最直观的品质表征，直接影响双孢蘑菇的适销性[5]。影响双孢蘑菇白度的因素有酶促褐变和非酶促褐变，其中酶促褐变是引起双孢蘑菇褐变的主要原因，是酚类底物在多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)的催化下氧化生成醌类物质，醌经自发聚合后，通过与蛋白质的氨基酸残基侧链基团反应产生黑色或褐色物质而引起褐变[6]；非酶促褐变中主要是羰氨反应(美拉德反应)[7]。乙醇是植物天然产生的次生代谢物质之一，徐莉等[8]研究表明，乙醇熏蒸处理鲜切菊芋能显著抑制PPO、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalamine ammonia-lyase，PAL)三种酶的活性，有效抑制了鲜切菊芋的褐变。YAN等[9]用200 mL/L乙醇处理鲜切莴苣，结果表明乙醇通过抑制PAL基因的表达影响PAL活性，进而抑制鲜切莴苣褐变。前期研究表明浓度为400 μL/L(乙醇溶液体积与泡沫箱体积比)的乙醇熏蒸处理对双孢蘑菇有较好的保鲜效果，本文旨在研究400 μL/L乙醇熏蒸处理对双孢蘑菇的护色作用，为探索双孢蘑菇安全高效的护色方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜双孢蘑菇，购于北碚天生农贸市场。要求同批采收，无病虫害和机械损伤，菇体成熟度、大小、形状、颜色均匀一致，采后8 h内运送至实验室。

L-苯丙氨酸、无水对氨基苯磺酸、α-萘胺、盐酸羟胺，成都市科龙化工试剂厂；愈创木酚，重庆北碚化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

Pac Check®Model 650EC顶空分析仪，美国MOCON公司；HWS低温恒温恒湿箱，宁波东南仪器有限公司；H1650R台式高速冷冻离心机，湖南湘仪公司；UV-2450PC紫外可见分光光度计，日本岛津公司；UltraScan®PRO测色仪，美国HunterLab公司。

1.3 样品处理

挑选大小一致，无开伞，无病害，无机械损伤的双孢蘑菇进行处理。将双孢蘑菇随机分为2组，每组双孢蘑菇800 g左右，放入泡沫箱内，同时放入展开的4层纱布(远离双孢蘑菇)，分别取一定量的乙醇(95%)均匀滴在纱布上，立即密封，室温(25℃)熏蒸处理3 h。试验中乙醇熏蒸浓度分别为0(CK)、400 μL/L(乙醇溶液体积与泡沫箱体积比)，处理结束后，将双孢蘑菇通风30 min后放入(3±1)℃的冷藏柜预冷30 min，最后分装到聚乙烯(polyethylene，PE)塑料袋(厚度为40 μm)内封口，每袋(100±5)g，每组3个平行。将包装后的双孢蘑菇置于(3±1)℃的冷藏柜中贮藏12 d，每2 d测定1次指标。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 呼吸强度

呼吸强度采用静置法经顶空分析仪进行测定[10]。用顶空气体分析仪检测大气中的CO2含量，记为ψ0，随机选取双孢蘑菇80 g，放入干燥皿中密封，25℃下静置30 min，检测干燥皿中CO2含量，记为ψ1。呼吸强度以每小时每千克双孢蘑菇在呼吸代谢过程中释放的CO2的质量表示。按公式(1)计算：

(1)

式中：ψ0，大气中CO2体积分数，%；ψ1，干燥皿中CO2体积分数，%；V，干燥皿中密闭空间的体积，mL；m，双孢蘑菇质量，kg；t，测定时间，h；1.96，CO2的摩尔质量/摩尔体积之比(=44/22.4；按标准状况下计算)。

1.4.2 PPO活性

参考OMS-OLIU等[11]方法并略做修改。双孢蘑菇去皮后，每组随机取菌盖上白色肉质3 g，置于研钵中，加入3 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成浆，于4 ℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清液即为酶提取液。往试管中加入4 mL 0.1 mol/L、pH 6.8磷酸缓冲液和1.0 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液和100 μL酶提取液。记反应体系在波长420 nm处吸光度值，以每克果蔬样品每分钟吸光度变化值增加0.01为1个活性单位。

1.4.3 POD活性

参考MOERSCHBACHER等[12]方法并稍作修改。双孢蘑菇去皮后，每组随机取菌盖上白色肉质3 g、3 mL提取缓冲液，在冰浴下用研钵研磨成浆，于4 ℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清液即为酶提取液。取一试管，加入3 mL 25 mmol/L愈创木酚溶液、0.5 mL酶提取液、200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液后开始计时。在470 nm处测吸光度值，以每克果蔬样品每分钟吸光度变化值增加0.01为1个过氧化物酶活性单位。

1.4.4 PAL活性

参考曹健康等[13]的方法。

1.4.5 总酚

参照ZHOU等[14]方法。

1.4.6 超氧阴离子产生速率

参考YAN等[15]方法。双孢蘑菇去皮后，每组随机取菌盖上白色肉质3 g、3 mL提取缓冲液(1 mmol/L EDTA、0.3%TritonX-100、2%PVP、50 mmol/L pH 7.8磷酸缓冲液)，在冰浴条件下用研钵研磨成浆，于4 ℃、12 000×g离心30 min，收集上清液即为酶提取液。取1 mL酶提取液，加入1 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸缓冲液和1 mL 1 mmol/L盐酸羟胺溶液，摇匀并在25℃保温20 min。取出后加入1 mL 17 mmol/L 对氨基苯磺酸溶液和1 mL 7 mmol/L α-萘胺溶液，混匀后在25℃保温20 min进行显色反应后在530 nm处测其吸光度值，以每分钟每克双孢蘑菇产生的超氧阴离子的物质的量作为其产生速率(μmol/(min·g))。

1.4.7 相对电导率

参考蒋冬花等[16]的方法。

1.4.8 还原糖

参考李合生[17]的方法。

1.4.9 游离氨基酸

采用茚三酮显色法[18]进行测定。

1.4.10 白度值

参考JAWORSKA等[19]方法，采用UltraScan®PRO测色仪对双孢蘑菇伞盖的白度值进行测定。用L*表示，L*值越大，颜色越白。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2010进行数据整理，IBM SPSS Statistics 22进行统计分析和LSD法显著性差异检验，显著性水平为0.05，通过Origin 8.6制图。

2 结果与分析

2.1 乙醇熏蒸对双孢蘑菇呼吸强度的影响

由于菇体采收后无法再从栽培介质中获取养分，其往后生理代谢所需的能量必须由本身贮存的物质所供应[20]。呼吸强度是影响双孢蘑菇耐贮性的重要因素，呼吸强度越大，双孢蘑菇生理老化和衰老进程越快，褐变越严重[21-22]。如图1所示，贮藏期间2组双孢蘑菇的呼吸强度呈先上升后下降的趋势，均在贮藏第2天达到呼吸高峰，处理组极显著地降低了呼吸峰值(p<0.01)，并在整个贮藏期间与对照组差异显著(p<0.05)。由此可见，400 μL/L乙醇熏蒸处理能显著抑制贮藏期间双孢蘑菇的呼吸强度，可能是因为乙醇抑制了乙烯合成相关酶[1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACS)、1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase，ACO)]的活性，从而抑制乙烯诱导的呼吸作用[23]。另有研究表明乙醇处理可以抑制香蕉[24]、西兰花[25]、草莓[26]、桃[27]的呼吸强度。

图1 乙醇熏蒸对双孢蘑菇呼吸强度的影响Fig.1 Effects of ethanol fumigation on respiration rate of Agaricus bisporus

2.2 乙醇熏蒸对双孢蘑菇PPO活性的影响

PPO是由核编码的含铜金属酶，是双孢蘑菇体内的褐变关键酶[28]。在有氧条件下，PPO能催化单酚通过羟基化作用形成相应的O-联苯酚，O-联苯酚进一步氧化成O-苯醌，醌具有很强的亲电子性，会聚合成褐色或黑色色素[29]。如图2所示，在整个贮藏过程中PPO活性呈上升趋势。在0～2 d PPO活性上升急促，可能是由于刚采摘的双孢蘑菇切掉根部时，机体做出相应的应激反应，使PPO活性增强[30]。乙醇处理组与对照组在贮藏4～8 d有显著差异(p<0.05)，在10～12 d差异极显著(p<0.01)，12 d时，乙醇处理组PPO活性比对照组低27.6%。可见，乙醇熏蒸处理能有效抑制双孢蘑菇PPO活性，有研究发现25%乙醇溶液能通过竞争与PPO酶活中心基团结合抑制PPO酶活性[31-32]，此外，乙醇熏蒸处理在桃果实[33]、油豆角[34]上的应用也得到相似结论。

图2 乙醇熏蒸处理对双孢蘑菇PPO活性的影响Fig.2 Effects of ethanol fumigation on the polyphenol oxidase activity of Agaricus bisporus

2.3 乙醇熏蒸对双孢蘑菇POD活性的影响

POD是果蔬体内一种重要的氧化还原酶，参与多种生理过程，POD在H2O2存在的条件下，使酚类物质氧化生成醌类，导致组织褐变[35]。如图3所示，在整个贮藏期间双孢蘑菇POD活性呈波动上升。贮藏第2天，两组POD活性急促上升，可能是因为采后切根胁迫刺激增强了双孢蘑菇抗氧化系统。2～6 d乙醇处理组POD活性呈下降趋势，与对照组存在显著差异(p<0.05)。6～8 d两组POD活性都呈上升趋势，可能是由于超氧阴离子产生速率增加使POD反应的关键底物H2O2含量增加，从而诱导POD活性增大[36]。第12天，相对于对照组，乙醇处理组将POD活性降低了33.19%，两组之间存在极显著差异(p<0.01)。与XU等[37]研究发现500 μL/L乙醇熏蒸处理能抑制西兰花POD活性的结果一致。

图3 乙醇熏蒸处理对双孢蘑菇POD活性的影响Fig.3 Effects of ethanol fumigation on the peroxidase activity of Agaricus bisporus

2.4 乙醇熏蒸对双孢蘑菇PAL活性的影响

PAL是催化酚类合成的关键酶，它能催化L-苯丙氨酸去氨基作用生成反式肉桂酸，并在此过程中产生酚类物质[38]。如图4所示，在0～2 d，PAL活性呈急速上升趋势，可能是由于双孢蘑菇贮藏前切根处理的外界胁迫，导致PAL活性的快速上升[39]。2 d后，乙醇熏蒸处理组能明显抑制PAL活性，与对照组差异极显著(p<0.01)，乙醇熏蒸处理组在整个贮藏期间都能有效地抑制双孢蘑菇的PAL活性。YAN等[40]研究表明200 mL/L乙醇溶液处理能抑制鲜切莴苣PAL基因的表达，抑制酶促褐变底物酚类物质的合成，从而抑制褐变。冯晓汀等[41]也得出乙醇处理鲜切西兰花能明显抑制其PAL活性的结论。

图4 乙醇熏蒸处理对双孢蘑菇PAL活性的影响Fig.4 Effects of ethanol fumigation on the phenylalamine ammonia-lyase activity of Agaricus bisporus

2.5 乙醇熏蒸对双孢蘑菇超氧阴离子产生速率的影响

通过呼吸作用进入生物体内的氧分子，接受一个电子后，转变为超氧阴离子等活性氧[42]，过多的活性氧会引起脂质过氧化，使维持细胞区域化的膜系统受到瓦解或损伤，进而诱发或加重双孢蘑菇褐变[43-44]。如图5所示，在整个贮藏期间双孢蘑菇超氧阴离子产生速率呈先升高后下降的趋势，0～4 d超氧阴离子产生速率持续增加，可能与0～4 d期间双孢蘑菇呼吸强度较高导致氧气进入菇体较多，超氧阴离子产生速率较高有关。后期超氧阴离子产生速率下降，可能与呼吸强度下降和抗氧化酶参与活性氧清除有关。第12 d，乙醇处理组的超氧阴离子产生速率显著低于对照组(p<0.05)。总之，乙醇熏蒸处理能有效抑制双孢蘑菇贮藏期间内的超氧阴离子产生速率。邸雅琼等[45]研究表明，2 mL/kg乙醇熏蒸处理降低了枇杷果实中超氧阴离子产生速率。

图5 乙醇熏蒸处理对双孢蘑菇超氧阴离子产生速率的影响Fig.5 Effects of ethanol fumigation on the superoxide radical production rate of Agaricus bisporus

2.6 乙醇熏蒸对双孢蘑菇总酚含量的影响

酚类物质是酶促褐变的底物，双孢蘑菇子实体中酚类物质含量高，较高的酚含量赋予双孢蘑菇较强的褐变潜力[46]。如图6所示，在整个贮藏过程中总酚含量呈先增加后下降趋势。0～2 d总酚含量增加，并且第2天达到峰值，可能是因为双孢蘑菇贮藏前切根处理的外界胁迫，加快了苯基丙酸类合成途径，促进酚类物质的合成、积累[47]。2 d后，2组总酚含量都持续下降，一方面可能因为与酶类反应结合，另一方面可能是作为氢供体参与自由基清除而消耗[48]。在2～12 d，乙醇熏蒸处理组总酚含量明显低于对照组(p<0.05)。可见，400 μL/L乙醇熏蒸处理能降低双孢蘑菇总酚含量，这与CHOI等[49]在鲜切生菜上的研究结果一致。

图6 乙醇熏蒸对双孢蘑菇总酚含量的影响Fig.6 Effects of ethanol fumigation on total phenol content of Agaricus bisporus

2.7 乙醇熏蒸对双孢蘑菇相对电导率的影响

相对电导率即为溶液中溶质的渗出率，从而间接表示细胞膜结构的完整性，相对电导率越大，表示细胞膜破坏越严重[50]。如图7所示，随着贮藏时间的延长，相对电导率呈上升趋势。贮藏2 d后，乙醇熏蒸处理组相对电导率显著低于对照组(p<0.05)，到第12天，处理组相对电导率为22.72%，而对照组相对电导率已达到26.51%。整体来看，乙醇熏蒸处理能有效抑制双孢蘑菇相对电导率的增加，这可能与乙醇能调整细胞膜结构并维持其完整性有关[51]。另外贾慧慧等[52]研究发现，300 μL/L乙醇熏蒸处理能保持桃果实中较低的相对电导率和MDA含量，从而减轻逆境对膜系统的伤害。

图7 乙醇熏蒸处理对双孢蘑菇相对电导率的影响Fig.7 Effects of ethanol fumigation on relative conductivity of Agaricus bisporus

2.8 乙醇熏蒸对双孢蘑菇还原糖含量的影响

还原糖中的羰基或羰基化合物与氨基化合物反应，生成具有特殊香味的棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精或拟黑素，即为羰氨反应[10]。羰氨褐变是非酶促褐变的重要途径，还原糖作为羰氨反应的直接反应物，其含量的变化对非酶促褐变有较大影响[46]。如图8所示，贮藏期间双孢蘑菇还原糖含量呈先上升后下降趋势。0～4 d还原糖含量呈上升趋势，可能是因为前4 d呼吸强度较高，消耗分解了淀粉等很多大分子化合物，使还原糖含量上升，在2～4 d两组差异显著(p<0.05)。4 d后2组还原糖呈下降趋势，到第12天时，处理组还原糖显著低于对照(p<0.05)。可见，400 μL/L乙醇熏蒸处理能降低双孢蘑菇还原糖含量。

图8 乙醇熏蒸处理对双孢蘑菇还原糖含量的影响Fig.8 Effects of ethanol fumigation on reducing sugar content of Agaricus bisporus

2.9 乙醇熏蒸对双孢蘑菇游离氨基酸含量的影响

双孢蘑菇中蛋白质降解生成的氨基酸，一部分参与蛋白质的再次合成和自身分解消耗，另一部分以游离氨基酸的形式存在于蘑菇体内，氧气的供给使细胞膜透性增大，并将这些游离氨基酸氧化成醌等有色物质，使子实体色泽变暗，组织松软[53]。如图9所示，在整个贮藏期间双孢蘑菇游离氨基酸含量呈先上升后下降的趋势。0～4 d游离氨基酸含量持续上升，可能是因为前4 d呼吸代谢旺盛使得蛋白质水解快，导致游离氨基酸积累，处理组游离氨基酸含量明显低于对照(p<0.05)。4 d后，2组游离氨基酸含量降低，对照组波动较大，可能是因为游离氨基酸与糖类发生羰氨反应导致含量不稳定。整体来看，在贮藏期间对照组游离氨基酸含量波动较大，而处理组变化相对平缓且含量处于较低水平，可知乙醇熏蒸处理能有效抑制蛋白质水解，保持较低游离氨基酸含量。

图9 乙醇熏蒸对双孢蘑菇游离氨基酸含量的影响Fig.9 Effects of ethanol fumigation on free amino acid content of Agaricus bisporus

2.10 乙醇熏蒸对双孢蘑菇白度的影响

白度值是双孢蘑菇重要的评价指标。一般地，当L*>80时，双孢蘑菇具有较好的品质，零售商与消费者均可接受；当L*在69～79时，虽然仍具有较好的风味，但外观上已不被消费者接受[54]。如图10所示，随着贮藏时间的延长，双孢蘑菇白度值呈下降趋势。2 d后，对照组白度值明显低于处理组(p<0.05)，6 d后，2组之间存在极显著差异(p<0.01)。可见，400 μL/L乙醇熏蒸处理能有效延缓贮藏期间双孢蘑菇白度值的下降。

图10 乙醇熏蒸对双孢蘑菇白度的影响Fig.10 Effects of ethanol fumigation on the whiteness of Agaricus bisporus

3 结论

研究表明，400 μL/L乙醇熏蒸处理能有效抑制双孢蘑菇PPO、POD、PAL活性并降低总酚的含量。同时，400 μL/L乙醇熏蒸处理能有效抑制双孢蘑菇呼吸强度、超氧阴离子产生速率，维持细胞膜结构的完整性。可见，乙醇熏蒸处理从抑制酶活、底物合成，维持细胞膜完整性三方面抑制双孢蘑菇的酶促褐变。此外，400 μL/L乙醇熏蒸处理能有效降低双孢蘑菇还原糖和游离氨基酸含量，从而抑制羰氨反应引起的非酶促褐变。综上所述，400 μL/L的乙醇熏蒸处理能抑制双孢蘑菇酶促褐变、羰氨反应的发生，进而延缓贮藏期间双孢蘑菇白度值的下降，达到理想的护色效果。