诺丽果控温发酵过程中理化性质和活性物质的变化规律

郝玉洁，毛丙永，崔树茂，易美华，洪启恩，陈卫，赵建新*

1(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)2(海南诺尼生物工程开发有限公司，海南 海口，570100)

诺丽发酵汁是在波利尼西亚流传了2 000多年的传统食物和药物。诺丽果因为成熟后质地软烂，容易破损[1]，不易运输和保存，因此就地发酵是较好的处理方法。诺丽果具有很高的营养价值，许多热带地区开始了具有规模性的诺丽发酵汁的生产与销售。诺丽果发酵大多采用长时间密封静置发酵的方式，但不同地区、不同厂家采用的发酵条件并不统一，缺乏明确的指标，产品标准不统一、品质不稳定，缺乏对诺丽发酵过程的研究。因此，研究诺丽发酵过程中理化和成分变化规律是十分必要的，根据变化规律来指导生产，保证产品品质稳定[1-6]。

诺丽果中含有大量活性物质，如多酚[3-4]、黄酮、多糖和环烯醚萜类物质，有机酸、挥发性风味物质等[7]，对产品质量具有重要影响。本文以西沙诺丽果为研究对象，通过研究诺丽果汁发酵过程中关键理化指标(pH值、总滴定酸度、可溶性固形物)、活性成分(总糖、总酚、环烯醚萜等)以及有机酸、挥发性风味物质等的变化规律，为诺丽果汁发酵提供研究基础，具有重要的指导意义和参考价值。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

诺丽果由海南诺尼生物工程开发有限公司提供。车叶草苷酸和去乙酰车叶草苷酸来自于南京森贝伽生物科技有限公司；氢氧化钠、蒽酮、浓硫酸、福林酚试剂和碳酸钠等试剂均来自于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

WAY-2W阿贝折光仪，上海仪电物理光学仪器有限公司；UV1800紫外可见光分光光度计，日本岛津公司；气相色谱-质谱联用仪1300-ISQ Thermo/Trace GC-MS，赛默飞世尔科技公司；超高效液相色谱-质谱联用仪UPLC-TQD ，美国沃特世公司；高效液相色谱仪Waters 1525EF ，美国沃特世公司。

1.3 实验方法

1.3.1 诺丽果汁的制备方法

取新鲜的诺丽果洗净表面，沥干后置于密封发酵罐中，于37 ℃恒温培养箱中发酵，定期从发酵罐中取出诺丽果浸出汁并保存在-80 ℃冰箱，以备检测使用。

1.3.2 pH、总滴定酸度(total titratable acid，TTA)和可溶性固形物(total soluble solids, TSS)的测定

pH和TTA的检测方法参考国标《GBT 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法》。TSS的测定方法按照国标《GBT 12143—2008 饮料通用分析方法》。

1.3.3 有机酸的测定

诺丽果汁中有机酸参考丁仁君[8]的方法。将诺丽果汁离心后微滤(0.45 μm)过膜，HPLC分析。采用Ecosil C18色谱柱，流动相为甲醇-水-H3PO4溶液(体积比95∶5∶0.05)，柱温30 ℃，流速0.8 mL/min，进样量为5 μL，UV检测(210 nm)。

1.3.4 总糖和总酚的测定

总糖采用蒽酮比色法进行检测。取10 mL待测样品于3 000 r/min离心10 min，取上清液适当稀释。取1 mL样品稀释液于具塞试管中，后加入4 mL蒽酮试剂，沸水浴10 min，冰水迅速冷却，于620 nm波长下测定吸光值。以葡萄糖标准溶液作标准曲线，计算总糖含量。

总酚采用福林酚法检测[9]。

1.3.5 环烯醚萜含量的检测

环烯醚萜采用UPLC-MS方法进行检测。取10 mL待测样品于3 000 r/min离心10 min。取1mL上清液加适量的甲醇水溶液稀释。稀释后的溶液过0.22 μm微孔滤膜待测。色谱条件如下：Waters XBridge C18柱，流动相(A)乙腈，(B)1%甲酸水溶液(v/v)，流动速率为0.3 mL/min。流动相按以下程序变化：0～0.5 min，3% A；0.5～6 min，3%～30% A；6～8 min，30%～50% A；8～9 min，50%A；9～10 min，50%～100% A；10～11 min，100% A；11～11.5 min，3% A。进样温度：130℃。进样量：1 μL。电离方式：ES-。电离能量：70 eV。监测离子：定量离子为m/z 389、431。以车叶草苷酸和去乙酰车叶草苷酸标准溶液绘制标准曲线，外标法定量。

1.3.6 挥发性成分的测定

挥发性成分测定采用GC-MS法。样品采用固相萃取法提取，萃取头型号为50/30 μm DVB/CAR/PDMS，样品在40℃下加热，插入萃取头萃取5 min，后插入进样口释放5 min。升温程序为初始温度40 ℃；30 ℃/min升温至60 ℃；10℃ /min升温至180 ℃；20 ℃/min升温至220 ℃，保温2 min。Rtx-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)，进口温度为230 ℃，分流比15∶1，柱流速1 mL/min，载气为氦气。质谱条件：离子化方式EI，发射能量为70 eV。采用面积归一化法表示各个挥发性成分的含量。

1.3.7 数据处理及分析

采用Origin 8.5对实验数据进行绘图，SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，选择Duncan进行显著性检验。

2 结果与讨论

2.1 诺丽果发酵过程中pH、TTA和TSS的变化规律

如图1所示，诺丽果汁在发酵过程中pH在60 d以前由3.9缓慢下降，在60 d以后稳定在3.6左右。WALL[2]等研究诺丽果在22 ℃下自然发酵时pH的变化范围为3.5～3.9，与本研究结果相符。总滴定酸度在20 d以前迅速上升，由7 mg/mL升至9 mg/mL，之后缓慢上升，在第100天TTA约为10.3 mg/mL。梁寒峭等人提到TTA的含量在灭菌前为8 g/L，pH为3.7，与本文结果相近[10-11]。由此可见，诺丽果汁在发酵60 d后pH和TTA已基本保持稳定。TSS在发酵前16 d变化不明显，这可能与前期诺丽果仍较硬、结构紧实有关。第16天到第30天，TSS迅速升高。30 d后可溶性固形物含量基本稳定，在7.5%～8%。

图1 诺丽果汁发酵过程中pH和TTA的变化情况Fig.1 Changes in pH and TTA during noni fermentation

图2 诺丽果汁发酵过程中可溶性固形物的变化情况Fig.2 Changes in the total soluble solids (TSS) during noni fermentation

2.2 诺丽果发酵过程中有机酸的变化规律

诺丽果发酵过程中TTA逐渐增加，为了探究具体有机酸的变化情况，针对甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、苹果酸和富马酸这8种有机酸进行检测。其中乙酸和富马酸的含量低于0.01 mg/mL，并未在图3中展示。由图3可以看出，发酵过程中含量变化最大的是丁酸，丁酸在发酵前6天含量上升，后迅速下降，这可能与诺丽果的成熟有关，经发酵可以有效减少丁酸这种不良气味的存在[7]。苹果酸、丙酸缓慢增加，戊酸和己酸缓慢降低，甲酸基本不变。苹果酸含量较高，是诺丽果中主要的非挥发性有机酸[12-13]。

图3 诺丽果汁发酵过程中有机酸的变化情况Fig.3 Changes in the organic acids during noni fermentation

2.3 诺丽果发酵过程中总糖和总酚的变化规律

由图4可知，在诺丽果发酵过程中总糖的含量呈波动性变化，基本维持在45～50 mg/mL的范围内。总酚含量的变化如图5所示。

图4 诺丽果汁发酵过程中总糖含量的变化情况Fig.4 Changes in the total carbohydrate content during noni fermentation

图5 诺丽果汁发酵过程中总酚含量的变化情况Fig.5 changes in total polyphenol contents during noni fermentation

总酚含量在前40天不断降低，尤其是在前20天从1.20 mg/mL迅速下降到1.05 mg/mL，到第40天缓慢下降到1.00 mg/mL，之后基本稳定。李雪等人比较西沙诺丽果汁和大溪地诺丽果汁时发现粗多糖含量为50～70 mg/mL，多酚的含量为1.1 mg/mL左右，与本文研究结果基本符合[9, 14]。长时间发酵会降低诺丽果汁的抗氧化能力[15]，多酚含量也会降低，因此诺丽果汁的发酵时间不宜过长。

2.4 诺丽果发酵过程中环烯醚萜的变化规律

诺丽果中的环烯醚萜类物质主要是车叶草苷酸和去乙酰车叶草苷酸两种，车叶草苷酸的含量在发酵过程中逐渐减少，而去乙酰车叶草苷酸的含量呈波动变化，一直维持在2 mg/mL的水平，结果表明随着发酵过程的进行，环烯醚萜类物质的含量变化不大。李雪等人采用HPLC对诺丽果汁中车叶草苷酸含量进行了测定，其检测结果为0.179 mg/mL，与本文研究结果相近[16]。

图6 诺丽果汁发酵过程中环烯醚萜类物质含量的变化情况Fig.6 Changes in the iridoids content during noni fermentation

2.5 诺丽果发酵过程中挥发性物质的变化规律

诺丽发酵果汁最显著的特点就是它奇特的味道，也正是这独特的味道让诺丽发酵果汁具有很高的辨识度。为了进一步探究诺丽果汁在发酵过程中的物质变化规律，先从较为明显的挥发性成分着手。采用SPME-GC-MS法分析了诺丽发酵果汁的挥发性物质，结果如图7所示。

图7 PCA法分析诺丽果汁发酵过程中挥发性物质的变化情况Fig.7 PCA analysis of changes in the volatile flavor compounds during noni fermentation

可以明显看出，第2、20、40天及第60～100天分别居于不同的4个象限，说明诺丽果汁的发酵过程是具有阶段性的，在发酵后期趋于稳定，处在一个阶段里。PINO等通过研究也指出诺丽果在自然发酵60 d后风味物质会达到稳定状态[17]，与本文的研究结果相吻合。

诺丽果汁挥发性成分共检测出46种，其中含量占比在1%以上的物质有7种(见表1)，代表了约80%的物质。其中己酸和辛酸是诺丽果汁中主要的挥发性有机酸，也是诺丽果汁腐臭味的主要来源。这与JORGE等人的研究结果相同[12]。此外，2-庚酮的显著性变化与诺丽果发酵的阶段特性相吻合，其他6种物质在发酵过程中变化不明显。己酸和辛酸的酯类化合物是诺丽果和诺丽果汁中较为典型的酯类化合物，大多数呈强烈的果味[18]。

表1 诺丽果汁挥发性成分中含量占比超过1%的物质的变化情况Table 1 Changes in volatile components of more than 1% during noni fermentation

注：表格中数值为含量占比的百分数，右上角的不同小写字母代表组别间差异显著(p<0.05)。

诺丽果汁挥发性成分中选取含量占比在0.1%以上的物质，共17种，代表了98%以上的挥发性物质。其中有显著性差异的有7种(见表2)。其中，2-甲基有丁酸的含量逐渐增加，在80 d后趋于平稳；1-吡咯烷甲腈和癸酸甲酯一直增加；2-庚酮、4-丁酸戊烯基酯、丁酸甲酯的含量阶段性减少；异丁烯酸甲酯一直减少。

2-甲基丁酸有辛辣味[19]，不容易被消费者接受，随着发酵时间延长并不有利于产品被新的消费者接受。2-庚酮[20]、丁酸甲酯和异丁烯酸甲酯都具有令人愉悦的果香，但在发酵过程中会逐渐减少，也不利于产品保留较好的风味。因此，较短的发酵时间可以尽可能地保留诺丽果汁的良好气味，更有利于被接受。

表2 诺丽果汁挥发性成分在发酵过程中显著变化物质的变化情况Table 2 Changes in volatile components with significant changes during noni fermentation

注：表格中数值为含量占比的百分数，右上角的不同小写字母代表组别间差异显著(p<0.05)。

3 结论

诺丽果汁的pH随发酵时间逐渐降低，在60 d后趋于平缓；TTA和TSS随发酵时间逐渐升高，在40 d后趋于稳定。多酚化合物的含量随发酵时间逐渐降低，在40 d后基本保持不变。多酚化合物的抗氧化能力与其含量成正比，因此缩短发酵时间，对提高诺丽产品的功效有重要的意义。

8种有机酸中，丁酸的含量在发酵10 d后迅速下降，其余有机酸的含量在发酵过程中变化均不明显。从挥发性物质的主成分分析结果看诺丽果的发酵具有明显阶段性，在60 d后基本稳定。根据2-甲基丁酸、2-庚酮、丁酸甲酯和异丁烯酸甲酯的含量变化结果，缩短发酵时间有利于保留诺丽果汁的良好风味，更容易被消费者接受。

综上，诺丽果汁的发酵过程是有阶段性的，在工艺允许的情况下缩短发酵时间有助于改善诺丽果汁的品质。