厚朴茎段的组织培养

金丽丽，张丽萍

(1.辽宁林业职业技术学院，沈阳 110101；2.辽宁省森林经营研究所，辽宁 丹东 118300)

厚朴为木兰属观花乔木，其组织培养处于初步探索阶段。刘贤旺等以凹叶厚朴(Magnoliaofficinalisvar.pubescens)为材料进行了组织培养，最适培养基为VB5+2,4-D 2mg/L+6-BA 1mg/L；其生长的最适培养基为VB5+2,4-D 1mg/L+6-BA 1.5mg/L。虽然植物的组织培养越来越受到众多科学工作者的重视，但关于厚朴组培苗的获得只停留在试验阶段，而真正用于生产的实用技术还非常少。本试验以厚朴茎段为材料进行了组织培养特性研究，试图找出适合该品种组培快繁的方法。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

厚朴当年生枝条。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的选取与消毒。取当年生、生长健壮的枝条，剪去叶，切成1.0～1.5cm小段，每段至少含1个腋芽。先将切割好的植物材料在自来水龙头下流水冲洗30min，然后再在洗涤剂溶液中浸泡5min后，用纱布扎住烧杯口(防止植物材料被冲出)，倒掉洗涤剂溶液，自来水龙头下流水冲洗35min。清洗后在超净工作台上进行表面灭菌，用0.1%的升汞(HgCl2)溶液小烧杯中浸泡15min，无菌水冲洗8次。

1.2.2 基本培养基筛选。将灭菌后的茎段放到灭菌滤纸上，并将其顶端和底部切掉约0.5cm(灭菌剂杀死的部分)后，再将剩余茎段切成1cm左右的小茎段，保证每个小茎段至少带有1个腋芽，插入诱导培养基上，每个培养瓶内接种一个培养物。

将无菌的茎段接到不添加任何植物生长调节剂的空白基本培养基中，供筛选的基本培养基有MS,1/2MS,改良MS。配制基本培养基，白糖3%，琼脂0.7%，光照14～16h，光照强度2000～2500 lx,温度22±2℃，pH5.8。每种处理20瓶，重复3次，60d统计生长情况。

1.2.3 初代培养基筛选。以基本培养基、BA、IBA、GA3三个因素三个水平进行试验，每瓶1株，重复3次，60d培养后及发芽数、发芽率，筛选出最优组合。

1.2.4 继代培养。厚朴经过无菌体系和初代培养后，打开盛有初代培养基的培养瓶，瓶口过火1次，用过火、冷却的镊子夹住分割的茎段并迅速转接在继代培养基瓶中，每瓶转接5～6个茎段，接完后瓶口过火封口。

1.2.5 生根培养。芽丛纵向切成单株，高度在1cm长以上的芽苗可进行生根培养(不足1cm的芽苗及愈伤组织用于继代培养)，以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的生长调节剂NAA，每个处理接种20瓶，重复3次，30d统计各处理的生根率和生根数。

2 结果与分析

2.1 基本培养基筛选

茎段接种60d，3种培养基在一定程度能够促进无菌茎段的生长，其中MS效果最不明显，MS培养基中的茎段无明显变化，1/2MS培养基叶片伸展，茎节伸长,萌生苗健壮，改良MS培养基培养的茎段叶片伸展，细长，易倒。综合考虑，选择1/2MS基本培养较为合适。

2.2 植物生长调节剂种类的筛选

以1/2MS作为初代培养基的基本培养基，添加不同浓度的激素组合，筛选出适合外植体生长的激素种类。试验结果见表1。

表1 植物生长调节剂对生长的影响

从表1中可以看出，添加6-BA，NAA，IBA都能在一定称度上促进茎段萌生苗的生长，叶片颜色正常，但添加GA3没有新叶长出，在一定称度上抑制萌生苗的生长。因此初步选择6-BA，NAA，IBA，其中6-BA分裂素和生长素NAA，IBA组合，经过观察萌生苗的生长状态，表明6-BA和NAA组合更有利于腋芽的萌发和健壮的生长。

2.3 初代培养基筛选

从表2中可以看出，接种90天后，外植体在各种激素配比中的生长情况有一定差别。培养基中添加6-BA时，外植体的平均萌动率随NAA浓度的增大而明显下降，NAA浓度为1.0mg/L时，外植体平均萌动率最低，为25%，萌动较慢，无叶片展开，最后出现褐化、死亡现象。NAA浓度为0.2mg/L时，外植体基部产生白色愈伤组织，接种90d一直保持愈伤组织状态，直至外植体枯死。NAA浓度为0.5mg/L时，外植体生长明显，保持萌动状态，茎尖分化较好，每一个叶腋都有腋芽长出，且没有愈伤组织。

表2 不同培养基对萌发率的影响

综合考虑以上情况，外植体在BA 1mg/L和 NAA 0.5mg/L的组合中生长最好。

2.4 继代培养

将离体初代培养获得的厚朴无菌苗，剪刀和镊子灼烧灭菌后，左手水平持种苗瓶，右手持镊子，使种苗瓶瓶口与右手所持的镊子在同一水平线上，将芽丛从瓶中取出，放在无菌滤纸上，用手术刀和镊子配合对芽丛进行分割，并把每个小枝条切割成1～1.5cm的茎段，每个茎段上至少应带有1个腋芽。转入继代诱导的培养基BA 1mg/L和NAA 0.5mg/L中，能够获得腋芽发生型丛生苗。

2.5 生根培养

以1/2MS为基本培养基，分别添加不同浓度生长素，结果见表3。

表3 不同NAA浓度对试管苗的影响

NAA是植物组织培养中广泛应用于诱导不定根的生长素，且植物生长调节剂的浓度也起着决定性作用，结果表明，1.0mg/L对厚朴诱导试管苗生根有促进作用，生根率达65%，生根数为8，叶色浓绿，长势好。

3 小结

本试验采用厚朴茎段为初始外植体，将离体的植物材料经过表面灭菌接种在各种培养基中，建立起无菌体系，从而缩短了萌芽时间。1/2MS培养基中无机盐质量比例适中，能满足植物的生长。添加过高或过低的NAA浓度对厚朴的组织培养中都有抑制作用。适宜初代、继代培养基为1/2MS，附加BA 1.0mg/L和 NAA 0.5mg/L，生根培养基1/2MS+NAA 1.0mg/L进行培养。

厚朴在外植体的诱导培养基中使用1/2MS基本培养基生长良好。MS和改良培养基，其无机盐与离子浓度较高，尤其硝酸盐浓度较高，含有硝态氮，无铵态氮，和碘化钾，直接影响细胞生理生化活动，对离子通道也有调控作用，影响各种无机盐的吸收。1/2MS培养基好于MS培养基，主要是由于无机盐浓度降低，增进了植物体整体的协调发展，对低浓度硝态氮吸收要好于铵态氮的缘故。

生长素的作用主要是促进细胞伸长和细胞分裂，诱导受伤的组织表面一至数层细胞恢复分裂能力，形成愈伤组织，促进生根等。细胞分裂素有诱导芽的分化、促进侧芽萌发生长的作用。试验只是对厚朴的一个品种进行的研究，诱导培养基中细胞分裂素和生长素浓度的比例保持在2∶1，诱导效果较好。在某些方面和他人也有一定的差异[3]，这可能与其基因型差异和激素浓度有关，还须进一步研究。