野菊花等复方中药水煎液体外抗大肠杆菌活性研究

杨林松，王芳，纪蔚伟，沈玉环，丁淑敏2，朱孝霖2，壮子恒2

(1.常州大学 制药与生命科学学院，江苏 常州213264；2.常州市药品制造与质量控制工程重点实验室，江苏 常州213264)

0 引言

近年来，抗生素的普遍应用促进了耐药性细菌的急剧增长，导致细菌感染的治疗难度增大.而传统中药具有对细菌几乎不产生耐药性的优点，在预防和治疗细菌性感染疾病中发挥不可替代的作用.我国中药资源丰富，其开发和应用具有广阔前景[1,2].野菊花、薄荷和藁本有疏风散热、解毒消肿等功效，是治疗风热感冒的常用药.野菊花(ChrysanthemumindicumL.)为菊科多年生草本植物，其头状花序部分，在我国民间药用历史悠久，可以防治感冒，中国药典(2015版)收载其栓剂用于抗菌消炎[3].曾帅等人[4]使用野菊花水煎液体外抑菌，结表明果野菊花水煎液对试验用的12种菌株均有不同程度的抑菌作用.此外，白银亮等人[5]研究了野菊花水提液对豚鼠离体回肠收缩的影响及其抑菌作用，结果也表明了野菊花具有一定的抑菌能力.薄荷(MenthahaplocalyxBritq.)成分中的挥发油[6，7]，具有抗炎镇痛、抑菌、抗肿瘤、调节消化系统和平滑肌等生物活性.藁本(LigusticumsinenseOliv.)的干燥根茎部分，可以活血止血，用于治疗心血管疾病以及妇科疾病[8].为了更好地利用中草药的抗菌作用，常银子[9]、赵万鹏[10]等对以中草药为原料的提取液及其组合的抑菌效果进行了试验研究，发现与单一原料提取液的抑菌作用相比，复合提取液对常见菌种均具有很强的抑制作用.本研究采用水煎法,对野菊花、薄荷和藁本为原料的提取液组合的抑菌效果进行了试验研究.验证其对大肠杆菌的抗菌性，进而为临床上细菌性感染的治疗提供参考.

1 材料

1.1 中药

野菊花的干燥头状花序、薄荷的干燥地上部分和藁本的根茎及根等3种中药购自江苏常州万仁大药房有限公司.

1.2 菌种来源

大肠杆菌菌种(Escherichiacoli)来自常州大学制药与生命科学学院微生物实验室.

1.3 培养基

LB固体培养基：含有胰蛋白胨10 g、酵母浸出粉5 g、氯化钠10 g、琼脂18 g、水1 L，pH7.0.

胰蛋白胨，北京奥博星生物科技有限责任公司；牛肉浸膏、琼脂、酵母浸膏，南京大治生物科技有限公司；氢氧化钠、氯化钠，国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯.

1.4 主要的仪器设备

生化培养箱，上海新苗医疗器械有限公司；压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司.

2 实验方法

2.1 中药的制备

取两副复方中药(野菊花30 g，薄荷5 g，藁本10 g)及大葱白10 g放入砂锅中，加1000 mL的蒸馏水，将中药浸泡在水中1 h；100 ℃加热30 min，过滤，收集滤液；滤渣中加入500 mL的蒸馏水，加热100 ℃ 30 min，过滤，收集滤液；将两次滤液混合加热浓缩至100 mL.生药浓度为1000 g/L；将药液倒入50 mL塑料试管中贮存在4 ℃的冰箱中备用.

2.2 实验菌液的制备

菌种的斜面培养基均为LB培养基.将大肠杆菌接种到斜面培养基，37 ℃培养24 h；培养活化：从斜面培养基挑取1环大肠杆菌接入50 mL LB液体培养基中，于37 ℃培养24 h，比浊管比浊，将菌液配成108CFU/mL，备用.

2.3 抑菌圈实验

采用药敏纸片法测定大肠杆菌的抑菌圈大小.配制LB琼脂培养基，121 ℃高压灭菌20 min，分装到培养皿中，每个平皿中15～20 mL培养基，制成平板；倍比稀释的中药液浓度依次为62.5、125、250、500、1000 g/L；涂布菌液(大肠杆菌菌悬液0.1 mL注入LB培养皿)，培养皿底部划分为5个区域并标号，每个培养皿作3个平行对照；直径1 cm的滤纸片分别浸满不同浓度的水煎液，按药液稀释度由高到低的顺序依次放置在培养皿中的1～5号区域内；37 ℃培养24 h后，测定抑菌圈直径，直径大小以mm为单位.

2.4 最低抑菌浓度和最低杀菌浓度检测

2.4.1 最低抑菌浓度检测

按试管2倍稀释法检测最低抑菌浓度(MIC).取7只高压灭菌试管，各管分别加入1 mL液体LB培养基，在第一管中加入中药水煎液1 mL(1000 g/L)，混匀后取1 mL加入2号试管中，2号试管混匀后取1 mL加入3号试管中，3号试管混匀后取1 mL加入4号试管中，依次稀释至6号管，6号试管混匀后取1 mL弃去，7号管中不加水煎液作对照，稀释后的浓度分别为：500、250、125、62.5、31.25、15.63 g/L、空白.各管分别加入用生理盐水稀释成含菌量为108CFU/mL的实验菌液0.1 mL，混匀，37 ℃培养24 h后观察大肠杆菌生长情况.判定无浑浊的试管的最低浓度即为MIC.

2.4.2 最低杀菌浓度的检测

以判定为最低抑菌浓度的试管为界，从该标号前的试管中分别取出0.1 mL均匀涂布于LB平板培养基中，将培养皿放置在37 ℃培养18 h，计数菌落.以菌落数少于5个(3个复孔平均值)的药物最高稀释度为药物对大肠杆菌的最低杀菌浓度(MBC).

2.5 大肠杆菌在不同浓度水煎液下的生长曲线

配制LB液体培养基分装到5个锥形瓶中，1号瓶50 mL，2号瓶46.875 mL，3号瓶43.75 mL，4号瓶37.5 mL，5号瓶25 mL.121 ℃灭菌20 min；将药液置于超净工作台中，紫外杀菌25 min；5个锥形瓶中分别加入水煎液0、3.125、6.25、12.5、25 mL，至其终浓度分别为空白、62.5、125、250、500 g/L；4个锥形瓶中分别接入大肠杆菌菌悬液，按1%的接种量接种，以加入菌液开始计时，此时计为0 h，用光电比浊计数法测此时的光密度值，然后将5瓶培养液放入空气浴振荡器内培养，培养条件是37 ℃ 157 r/min，每2 h测一次培养液吸光度，用OD600表示大肠杆菌增殖的速率.

2.6 统计学分析

所有实验数据以平均值±标准误表示，P<0.05表示与对照组相比有显著性差异，P<0.01表示有极显著性差异.

3 实验结果

3.1 抑菌圈

药物对大肠杆菌抑菌圈实验结果如图1所示.1000、500、250和125 g/L浓度组可见滤纸片的周围存在明显的抑菌圈，在62.5 g/L浓度组区域滤纸片周围抑菌圈不明显.

图1 大肠杆菌抑菌圈Fig. 1 The bacteriostatic ring of Escherichia coli

通过表1可知，该中药水煎液在浓度≥125 g/L时，对大肠杆菌存在较明显的抑菌圈，1000 g/L时最为明显，与最低浓度组相比有显著差异，且抑菌圈直径大小呈现一定的药液浓度依赖性，即药液浓度越高，抑菌圈直径越大.

表1 复方中药水煎液对大肠杆菌抑菌圈直径的影响Tab. 1 The influence of Chinese traditional compound medicine water decoction on the bacteriostatic circle diameter of Escherichia coli

注: *.P<0.05，与最低浓度组相比有显著差异；

**.P<0.01，与最低浓度组相比有极显著差异

3.2 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)

3.2.1 中药液处理大肠杆菌24 h后MIC的确定

由图2可知，不同浓度的药液处理大肠杆菌培养24 h后，250 g/L和500 g/L浓度组试管药液浓度较深，未出现浑浊.而15.63、31.25、62.5、125 g/L浓度组试管底部开始出现菌落絮状沉淀.对照管为未加药液培养24 h后的空白菌液，颜色为黄白色，较浑浊.由此可初步判定，该药液对大肠杆菌的MIC约为250 g/L.

图2 不同浓度药液处理大肠杆菌24 h后的MICFig. 2 MIC of Escherichia coli treated with different concentrations of water decoction

3.2.2 中药液对大肠杆菌最低杀菌浓度(MBC)的判定

取500、250、125、31.25 g/L和对照管含菌药液涂布平板，500、250 g/L号管内含菌药液不经稀释直接涂布平板，125、31.25 g/L号管含菌药液稀释100倍，对照管菌液稀释1000倍，37 ℃恒温培养24 h后观察菌落生长状况.500 g/L平板，54个菌落；250 g/L平板，菌落约为200个；125、31.25和对照管平板，菌液浓度过高，均为菌苔.由此判定，该复方中药对大肠杆菌的最低杀菌浓度MBC值为500 g/L.

3.3 大肠杆菌生长曲线

不同药液浓度下绘制的大肠杆菌的生长曲线如图3所示，药液浓度≥250 g/L时，可以延长大肠杆菌生长的调整期，对大肠杆菌有明显的抑菌效果.当药液浓度为62.5 g/L时，由于药效组分浓度较低，药液中含有丰富的营养物质如氨基酸，微量元素等是大肠杆菌生长所需，促进了大肠杆菌的生长.药液中抑菌成分的存在使大肠杆菌的对数期明显缩短，药液浓度越高，对数期越短.

图3 不同浓度水煎液作用下大肠杆菌的生长曲线Fig. 3 The growth curve of Escherichia coli treated with different concentrations of water decoction

图3的曲线虽然可以清晰地显示各个药物浓度处理培养液OD600值的变化趋势，但是难以比较不同浓度复方中药水煎液对大肠杆菌生长曲线的影响.设法剔除复方中药水煎液自身对OD600值的影响，将各条曲线置于同一起点上，见图4将有利于生长曲线的比较和分析.

从校正生长曲线图4可以看出，不同浓度的生长曲线的不同阶段均位于对照组之下，表明大肠杆菌的生长受到明显的抑制.同时，生长曲线的对数期一般比对照平缓，说明大肠杆菌需要生长一段更长的时间才可以达到稳定期，这一特征也可以看作是抑制作用的一个方面.

图4 大肠杆菌的校正生长曲线Fig. 4 The corrected growth curve of Escherichia coli

4 结论

用水煎煮法获取复方中药野菊花、薄荷和藁本的水煎液，具有一定的体外抗菌效果.药敏纸片法的结果显示该复方中药水煎液对大肠杆菌产生明显抑菌圈，且其对大肠杆菌的MIC为250 g/L，MBC为500 g/L；大肠杆菌生长曲线实验进一步表明在药液浓度>125 g/L时，中药水煎液对大肠杆菌有明显的抑菌效果，此实验结果与抑菌圈实验及大肠杆菌MIC实验结果基本一致.诸多中药具有抑菌或杀菌作用，其作用的菌种以及作用强弱各不相同[11-13]，其抑菌作用的机理可归纳为以下几点：中药有效成分的作用，与其他物质协同作用，药物的配伍影响等.中药抑菌作用研究的手段和方法都在不断地改进，从单味中药到复方中药[14]，但目前对中药抗菌作用的研究大多数都局限于体外，我们应该将中药抗菌作用的研究进一步深入到体内，从而推动中草药抗菌的研究和发展.

中药成分复杂，药效成分难以检测，本研究虽阐明该复方中药有抗菌作用，但对复方中药抗菌作用的机理，药物对细菌作用的靶点及细菌是否会有耐药性等仍不明确，这些是今后研究的热点.

致谢：本工作受到江苏省高校优秀中青年教师和校长境外研修项目的支持.