哈尔滨地区鸡大肠杆菌流行情况分析*

施路一，鞠丹，杨娇，那春子，任梦非

(黑龙江省野生动物研究所，黑龙江 哈尔滨 150081)

病原体感染通常是细菌性传染病暴发的主要原因[1]，相同种属的不同病原个体可能具有相同的毒力因子、生化特征及基因组特征，表明病原体间存在共同的进化源头，被称为流行病学相关菌株(epidemiologically)。分型技术是利用该特征对病原个体溯源，确定传播来源、流行范围，为防治措施提供信息。鸡致病性大肠杆菌作为一种条件性致病菌寄生于宿主鸡体内，当某些条件成熟时，导致鸡大肠杆菌病暴发。鸡致病性大肠杆菌与非致病性大肠杆菌无法严格区分。研究表明O型鸡大肠杆菌是主要的APEC血清型。O1、O2和O78等血清型鸡大肠杆菌常表现高致病力。在大肠杆菌系统进化分群中，B2和D系统进化群鸡大肠杆菌往往具有高致病力。本研究在此基础上以哈尔滨地区健康鸡为研究对象，采集泄殖腔拭子，对分离到的鸡大肠杆菌的血清型和系统进化分群进行分析，旨在明确哈尔滨地区鸡大肠杆菌的流行情况，尝试为鸡大肠杆菌病流行形势提供预警，并依此为基础，为养殖提供经验。

1 材料

伊红美蓝平板培养基、麦康凯琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基、普通肉汤、普通琼脂斜面参考文献[2]制备。158种大肠杆菌血清型鉴定用O型血清型，购自中国兽医药品监察所。并按说明书保存并使用。在哈尔滨市地区7家集约化养鸡场，采集健康鸡泄殖腔拭子276个，将样品拭子于4℃条件下保存，准备实验。

2 方法

2.1 大肠杆菌的分离 取菌株样品采集拭子接种于伊红美蓝平板培养基，37℃过夜；挑取特征菌落接种于麦康凯平板培养基，37℃过夜；挑取特征菌落接种于LB液体培养基，取增菌物与50%甘油作等比例均匀混合后-80℃保存[3]。

2.2 革兰氏染色镜检 用接种环挑取生理盐水，与适量细菌纯培养物混合，自然干燥后用火焰固定，草酸铵结晶紫染色2min后水洗，加卢戈碘液媒染1min后水洗，加95%酒精脱色30s后水洗，最后加番红复染液复染1min后水洗，自然干燥后镜检。

2.3 生化试验 用接种针挑取疑似大肠杆菌分离株穿刺接种并涂布三糖铁琼脂斜面培养基，37℃培养24h后观察培养基斜面和底部颜色变化以及产气情况。按文献[4]报道方法对所有分离株进行葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、侧金盏花醇、吲哚、M.R、VP、枸橼酸盐 10项生化指标的测定，以及淀粉酶试验、木糖、甘露糖、产硫化氢试验、尿素酶试验、触酶试验、运动性试验。

2.4 血清型鉴定 挑起菌株接种于普通琼脂斜面，37℃培养，24h后用0.5%石炭酸生理盐水洗下，形成浓缩菌液，121℃、2h，制备菌体抗原，按血清型鉴定试剂盒说明书进行平板凝集试验，鉴定血清型，将定型大肠杆菌冻干保存[3-4]。

2.5 大肠杆菌分离株系统进化群试验 参考文献[5]合成chuA、yiaA和DNA片段TspE4.C2的核酸序列，见表1。

表1 TspE4.C2的核酸序列

参考文献[6]三重PCR方法对各菌株进行系统进化分群鉴定，见表2。

表2 三重PCR方法对各菌株进行系统进化分群鉴定

PCR 参 数 如 下 ：95℃4min；95℃30s，59℃30s，72℃30s，30 个循环；72℃延伸 10min。 按 Clermont方法分析菌株分群，见图1。

图1 Clermont方法分析大肠杆菌系统进化群

3 结果与分析

3.1 鸡大肠杆菌的分离鉴定结果 在哈尔滨健康鸡群中共分离得到257株大肠杆菌。

分离株在伊红美蓝培养基上呈紫黑色，在麦康凯培养基上呈桃红色，符合大肠杆菌特征，镜检可见革兰氏阴性、两端钝圆小杆菌，散在或成对出现，无其他形态菌，初步鉴定为大肠杆菌纯培养物。生化试验鉴定，257个泄殖腔拭子样品分离株均符合大肠杆菌特征。

3.2 血清型鉴定 分离到鸡大肠杆菌有257株，定型220株，未定型26株，自凝 11株，共分为39个血清型，优势型为O8。与文献[7]报道较一致。其中 4.1%为 O2型，是仅次于 O8、O6、O17和 O46，具有提示意义。

鸡大肠杆菌鉴定结果见表3和表4。

表3 鸡大肠杆菌鉴定结果

表4 220株鸡大肠杆菌的O血清型

3.3 大肠杆菌分离株系统进化分群结果 对220株鸡大肠杆菌进行系统进化分群试验，PCR结果见图2。

图2 chuA、yiaA、TspE4.C2基因的扩增结果

参考文献[4]分群方法，220株鸡大肠杆菌进化群分群情况见表5。

系统进化分群认为，A和B1群属于共生菌，少见致病性。B2群和D群致病力较高。

结果表明共有30个血清型属于B2群和D群，占全部血清型的76.9%。在菌株方面，属于B2群和D群的菌株共有58株，占全部菌株的26.37%。

表5 220株鸡大肠杆菌进化群分群情况

4 讨论

目前致病性鸡大肠杆菌与非致病性鸡大肠杆菌无法严格区分。O型鸡大肠杆菌是主要的鸡致病性大肠杆菌[8]，常见血清型有 O1、O2、O35和O78等。辽宁省 APEC流行血清型为 O78、O57、O2、O1、O35、O157 和 O8[9]。山东省 APEC 优势血清型为O2、O35和O78[10]。本研究从健康鸡群中分离到257株大肠杆菌，除37株未确定血清型以及自凝外，共覆盖39种血清型，O8血清型占优势，其余 占 比 较 多 的 血 清 型 还 有 O6、O17、O46、O2、O161、O154、O9、O15、O20、O91 等。其中 O2 血清型是重要的致病性鸡大肠杆菌，该结果说明致病性鸡大肠杆菌可分布于健康鸡群。在本次研究中暂未对各血清型菌株致病力进行检测，但是在健康鸡群中分离得到的血清型众多，是引发鸡大肠杆菌病暴发的潜在威胁。

大肠杆菌种群依据chuA、yjaA基因和TspE4.C2非编码区可分为A、B1、B2和D四个系统进化群。其中，A和B1群常存在于共生株，而B2和D群属于携带毒力相关基因的条件肠外病原体。不同的系统进化群分布皆由动物种类、健康状态和所处地理位置决定的[4]。Obeng等[11]对南澳大利亚251株禽大肠杆菌进行研究，发现共生群(A和B1)占比分别为32.3%和39.4%，毒力群(B2和D)占比分别为11.2%和17.1%。Rodriguez等[12]研究美国患病家禽大肠杆菌发现，A群、B2群和D群分别占比38%、19%和28%。刘焕奇[13]等对我国鸡大肠杆菌系统进化分群情况的研究结果表明，各分群占比为 A(34%)、B1(38.1%)、B2(6.2%)和 D(21.2%)。在本研究中220株鸡大肠杆菌中A(38.64%)和 B1(35%)群共占比 73.64%，B2(9.55%)和 D(16.82%)群共占比26.37%，其中A和B1群占比与前述研究较为一致，D群占比与前述国外研究较一致，但低于刘焕奇等的研究结果。本研究在健康鸡群中分离到B2群鸡大肠杆菌，与刘焕奇等研究结果较为一致，但未见其它国家报道健康鸡群中B2群分离情况。上述结果提示哈尔滨地区鸡大肠杆菌可能具有较强致病力，尤其上述进化分群在健康鸡群中分离得到，也对鸡养殖中鸡大肠杆菌病的暴发风险具有一定预警意义。

5 小结

哈尔滨地区健康鸡群的泄殖腔拭子中分离到鸡大肠杆菌257株，O血清型有39种，其中O8为优势血清型。系统进化B2群和D群占全部菌株为26.37%。各分离菌株致病力暂未测定。研究结果表明当前哈尔滨地区鸡大肠杆菌血清型多样，毒力情况复杂，应建立针对性应急预案。