流式细胞CD64检测在鉴别类风湿关节炎合并感染中的意义

刘 洋，曹 玲，张朝霞

(新疆医科大学第一附属医院检验科，乌鲁木齐 830054)

类风湿关节炎(RA)是一种病因未明的、常见的，以侵蚀性、慢性、进行性多关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病。主要累及外周关节，以对称性、多关节滑膜炎为主，好发于手、腕、足等小关节，常反复发作。病理变化主要表现为滑膜炎、血管翳形成，侵蚀软骨及骨组织，最终可能导致关节结构破坏、畸形、功能丧失等。我国的患病率为0.32%～0.36%，是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要病因之一[1]。激素、免疫抑制剂被广泛应用于RA患者，当RA患者合并感染时，临床症状可表现为发热、关节痛、C反应蛋白(CRP)升高、红细胞沉降率(ESR)增快等，与RA病情活动很难区别，但两种情况的治疗方法完全不同。误诊会使患者使用过多的抗菌药物，造成不必要的经济损失；还会使患者使用免疫抑制剂如肿瘤坏死因子(TNF)-α等，造成感染加重。目前，感染已成为RA患者的主要并发症和死亡原因之一[2]。因此，寻找一种简便、可靠的指标来区别合并感染还是RA活动成为临床迫切需要解决的问题。

目前，常用的感染指标有白细胞、ESR、CRP等，在RA活动期上述感染指标水平也增高，但缺乏特异性；细菌培养耗时过久且阳性率低，给临床的及时治疗造成困扰。CD64近年来作为一种感染的新指标越来越受到关注[3-4]。研究发现中性粒细胞CD64的表达在RA疾病活动时不上调[5]，激素、免疫抑制剂和生物制剂等并不影响CD64的表达。这使得CD64有望成为鉴别RA病情活动与继发细菌感染的检测指标。本文探讨CD64、CRP、ESR及降钙素原(PCT)在RA合并感染中的意义与临床应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年9月至2017年6月来本院就诊的64例RA患者。诊断标准参照2010年美国风湿病学会(ACR)和欧洲抗风湿病联盟(EULAR)修订的RA分类标准和评分体系：DAS28以压痛关节数及肿胀关节数评分，以28 个关节计分，包括双手掌指关节(10个)、双手近端指间关节(10个)、双腕关节(2个)、双肘关节(2个)、双肩关节(2个)、双膝关节(2个)，DAS28评分大于2.6分为RA活动期[6]。根据临床诊断及病原学结果分为RA合并感染组和RA活动期组。RA合并感染组29例，其中男11例、女18例，平均年龄(54.76±14.48)岁；肺部感染18例，泌尿系统感染7例，皮肤感染4例。RA活动期组35例，其中男7例、女28例，平均年龄(53.57±11.95)岁。对照组为同期本院健康体检者30例，其中男9例、女21例，平均年龄(53.00±11.04)岁，无严重心脑血管疾病及肝、肾功能异常，无其他器质性疾病。以上3组的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2仪器与试剂 流式细胞仪(贝克曼库尔特FC500MCL)、TQ-PREP前处理仪、贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪、罗氏e411电化学发光分析仪。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗人CD64(IgG1.κ，克隆号10.1)、多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)标记的小鼠抗人CD45(IgG1.κ，克隆号2D1)、藻红蛋白(PE)标记的CD13、藻红蛋白花青素(PE-CY5即PC5)标记的CD33、别藻蓝蛋白(APC)藻红蛋白-得克萨斯红(ECD)标记的CD14。溶血剂和缓冲液均由Becton Dickinson公司(美国)生产。

1.3方法

1.3.1标本采集 抽取患者入院24 h内静脉血进行检测，于入院次日早晨空腹抽取3 mL 乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝静脉血，2 h内送检。同时抽取肝素抗凝静脉血进行CRP及PCT检测，抽取外周静脉血经枸橼酸钠抗凝后于ESR检测管中，在室温下测定1 h ESR。

1.3.2流式细胞术(FCM)检测CD64 取流式专用管，各管依次加入CD64-FITC 5 μL、CD45-PerCP 5 μL、CD13-PE 5 μL、CD14-ECD 5 μL、CD33-PC5 5 μL、EDTA全血70 μL。混匀试剂和抗凝血，在室温避光孵育15 min后，使用TQ-PREP前处理仪每管加入溶血剂(甲酸水溶液)1 mL，混匀后加入稳定剂(碳酸钠-氯化钠水溶液)500 μL，混匀后再加入固定剂(多聚甲醛-磷酸盐缓冲液)500 μL，前处理完毕后上流式细胞仪检测。利用前向散射光(FSC)、侧向散射光(SSC)和CD45-PerCP选取中性粒细胞群，调节荧光补偿后，检测中性粒细胞群细胞表面CD64表达的平均荧光强度(MFI)。每份标本检测8 000个细胞，数据由CXP Software获取和分析，所有操作均由专业人员完成，确保结果的准确性。

1.3.3CRP、PCT及ESR的检测 采用贝克曼库尔特AU5800 全自动生化分析仪测定CPR，采用罗氏e411电化学发光分析仪测定PCT；采用魏氏法检测ESR。仪器设备均通过质控，所有标本均在2 h内检测完成。

2 结 果

2.13组CD64、CRP、ESR、PCT结果比较 RA合并感染组CD64明显高于RA活动期组与对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，RA活动期组CD64水平与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。RA合并感染组CRP、ESR、PCT水平明显高于RA活动期组与对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，RA活动期组CRP、ESR与对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)，其余指标各组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2RA合并感染组、RA活动期组CD64与CRP、ESR、PCT的相关性 经线性相关分析，RA合并感染组CD64水平与CRP、ESR无相关性(r=0.072、0.388，P>0.05)；CD64水平与PCT呈正相关(r=0.409，P<0.05)。RA活动期组CD64水平与CRP、ESR、PCT也无相关性(r=-0.310、-0.167、0.544，P>0.05)。提示CD64的表达水平与RA病情活动无关。

2.3CD64、PCT的ROC曲线分析 将RA合并感染组与RA活动期组的CD64、PCT，绘制ROC曲线，比较曲线下面积(AUC)，计算灵敏度、特异度及cut off值。CD64、PCT的AUC分别为0.953、0.922，差异有统计学意义(P<0.05)。当cut off值为3.780时，CD64的灵敏度为82.8%，特异度为97.1%，其AUC最大(0.953)，与PCT的AUC(0.922)比较，差异有统计学意义(P<0.05)。行串联试验，计算CD64联合PCT的诊断效能，得出AUC为0.987，当二者同时阳性时，灵敏度为96.6%；当二者同时阴性时，特异度为97.1%，较单独诊断试验灵敏度和特异度提升。见图1。

表1 3组CD64、CRP、ESR、PCT结果比较

注：与RA合并感染组比较，aP<0.05;与RA活动期组比较，bP<0.05

图1 CD64、PCT的ROC曲线分析

3 讨 论

CD64是免疫球蛋白超家族的成员，相对分子质量为72×103的跨膜糖蛋白，主要分布在外周血的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞表面。非细菌感染时在中性粒细胞表面CD64呈低水平表达[7-9]；细菌感染或内毒素入侵时，CD64在受到刺激后4～6 h即可启动免疫应答，在诊断感染性疾病时灵敏度和特异度较高，可作为感染的早期诊断标志物之一，具有诊断优势。国内外有报道使用中性粒细胞CD64阳性率、中性粒细胞CD64/CD35比例等对RA合并感染进行鉴别诊断，均获得了满意结果[2-3]。本文研究了CD64、CRP、PCT及ESR在RA合并感染中的意义，结果显示RA合并感染组中性粒细胞CD64表达显著高于RA活动期组及对照组(P<0.05)，且RA活动期组与对照组CD64水平差异无统计学意义(P>0.05)，说明CD64的表达与RA的病情活动无关，这与KOMIYA等[4]、李德红等[5]的报道一致。

CRP是主要由白细胞介素(IL)-6驱动，在机体受到感染、炎症或组织损伤时血浆水平升高的一类急性时相反应蛋白。CRP在许多原核生物中存在，但也存在于坏死和凋亡的真核细胞中。RA病情缓解后CRP下降，是反映病情活动和治疗效果的较好指标。ESR具有操作简便、重复性好的特点，其在80%的RA患者病情活动期增快，但由于影响因素很多，不能仅仅依据ESR的升高与否来判断RA患者病情的活动情况。对于RA合并感染的情况，上述指标不能较好地判断。

PCT是由甲状腺的C细胞产生的早期激素，是无活性的降钙素前体，对感染尤其是细菌感染较为敏感，在全身性细菌感染、严重的组织创伤、严重休克、全身炎症反应综合征及多器官功能障碍综合征时明显增高[10-13]，真菌、病毒局部感染、肿瘤等疾病时仅表现为轻度升高或者不升高。在相关性分析中，RA合并感染组CD64水平仅与PCT呈正相关，表明CD64对细菌感染较为敏感。ROC曲线中当CD64 cut off值为3.780时，灵敏度为82.8%，特异度为97.1%，其AUC优于PCT(P<0.05)，表明CD64可作为诊断RA合并感染的指标，与张晶等[6]的研究一致。CD64与PCT二者联合诊断可提升诊断效能。

MAGNUSSON等[7]研究了CD64在RA患者单核细胞与免疫球蛋白中的水平和其在疾病活动中的作用。研究发现，在RA患者滑膜组织中，巨噬细胞FcγRⅡB及活化性FcγⅠ、FcγⅡ、FcγⅢ受体的表达均增加，关节腔注射抗炎药物后，滑膜中FcγRⅠ的表达较之前降低，提示FcγR在RA滑膜炎症发挥中心作用。活化性Fcγ受体参与吞噬、免疫复合物诱导的炎症和相关细胞炎症因子的释放。本研究中RA活动期组CD64水平与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，可能与样本量较少有关。

HUSSEIN等[8]的研究表明，活动期的RA患者滑液中CD64的表达升高较外周血中性粒细胞CD64升高明显。可能是由于关节内的细胞因子或其他因素，如免疫复合物的沉积导致。对重症监护病房(ICU)患者诊断脓毒症时，中性粒细胞CD64表现优于PCT和CRP[9]。CD64和CRP或PCT联合检测可提高脓毒症的诊断准确性。在ICU指导抗菌药物治疗时，这种方法可能是有用的。中性粒细胞CD64是目前诊断感染的著名标志物,有研究报道流式细胞定量测定中性粒细胞CD64还可能是淋巴瘤的诊断标志物[14-15]。

本文的不足之处：CD64对于RA合并感染的判断，其灵敏度为82.8%，但徐勤燕等[16]的相关报道中灵敏度可高达94.4%。原因可能为本研究入组的患者例数相对较少，并且存在地域、民族的差异性，患者来源群体的不同都可能导致灵敏度的不同。希望在以后的研究中纳入更多数量的患者及进行多中心的试验。通过这种方式，将有可能获得更加准确的数据，帮助临床的诊断及治疗，监测疾病，评估预后等。在今后的研究中，将继续研究自身免疫性疾病与CD64表达的关系，希望从中能发现有关疾病发生、发展的机制与原理，为临床更好地诊疗提供帮助与支持。

综上所述，中性粒细胞CD64在区分RA合并感染及RA病情活动中具有很好的灵敏度及特异度，可为早期诊断及治疗提供帮助。