黄淮稻区推广水稻品种稻瘟病抗性基因Pi9和Pi-ta的分子鉴定

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(河南粮食作物协同创新中心，河南省水稻生物学重点实验室，河南农业大学， 郑州 450002)

水稻是全球重要的粮食作物之一，我国50%以上人口以稻米为主食。稻瘟病又称稻热病，是由子囊菌引发的真菌性病害。水稻稻瘟病主要通过气流传播，在水稻生长全生育期均可发病，对水稻生产威胁极大，许多水稻品种因抗病性不佳，常造成严重损失，甚至绝产。利用抗稻瘟病基因培育抗稻瘟病水稻新品种是最有效的防治稻瘟病手段，也是分子育种的主要方向[1]。现已报道的抗稻瘟病基因有70多个抗稻瘟病位点的90多个主效基因，其中，Pia,Pib,Pik-m,Pik-p,Pita,Piz-t,Pi2,Pi9等24个基因已被成功克隆[2]。

Pi9是来源于小粒野生稻(Oryzaminuta)的稻瘟病抗性基因，为Piz位点上的复等位基因。Qu等[3]2006年克隆了该抗稻瘟病基因，该基因位于水稻6号染色体，含有6个串联的NBS-LRR。Pi9 cDNA全长为4 009 bp，含有2个长度分别为5 362 bp和128 bp的内含子；编码的蛋白产物氨基端含有NBS域，羧基端有17个不完整的LRR组成的富亮氨酸重复域。Pi9抗性比较广，据研究其对至少21个稻瘟病菌小种具有抗性，对来自13个国家的43个稻瘟病菌株均表现出很高的抗性[4]。分子标记辅助选择育种也发现，导入Pi9抗性基因能显著提高水稻的稻瘟病抗性[5-6]。Tian等[7]设计了Pi9的特异引物，并对中国434份种质材料进行检测，发现Pi9在中国粳稻材料中普遍存在，但是在籼稻材料中极少被发现。Pi-ta是来源于籼稻的广谱稻瘟病抗性基因。Pi-ta基因编码一个长度为928个氨基酸的细胞质膜受体蛋白，该膜受体蛋白含富亮氨酸结构域(LRD)和NBS结构域。Pi-ta介导的稻瘟病抗性必须有Ptr(t)的参与，且抗病反应是Pi-ta基因编码产物与稻瘟病菌的无毒基因AVR-Pita表达产物相互作用引发的[8-9]。抗稻瘟病基因Pi-ta与穗颈瘟抗性存在显著相关性，少数江苏省推广种植粳稻品种中具有Pi-ta抗性基因[10]。

注：M为DM 2 000；C 1为DX 60；C 2为日本晴；1～60见表1。图1 Pi9基因PCR检测

近年来，水稻稻瘟病抗病基因的克隆及分子标记的开发为水稻抗病分子育种提供了良好的机遇。本研究利用Pi9和Pi-ta基因的分子标记，对黄淮稻区主要种植的60份品种进行分子鉴定，明确这2个主效广谱抗病基因在品种中的分布状况，发掘抗稻瘟病的育种材料，为水稻抗病育种提供抗病亲本，对水稻绿色安全生产具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材 料

黄淮稻区推广种植的水稻品种60份，分别为豫粳6号，豫农粳6号，原稻108，郑稻11号，郑稻18，郑稻19，郑稻1号，郑稻4号，郑稻5号，郑粳107，大粮203，菡科18，越富，豫农粳12号，豫稻16，旱稻277，旱稻297，旱稻502，洛稻998，新旱2号，郑旱2号，郑旱6号，郑旱9号，郑旱10号，IRAT 109，丹东陆稻，秦爱，台东陆稻，红米，淮稻6号，淮稻8号，淮稻9号，津稻372，连粳10号，连粳11号，南粳42，南粳5055，南粳9108，宁粳3号，宁粳4号，农香粳，圣稻16，泰香2号，武香粳14号，武育糯16号，武育糯6号，武运粳23，武运粳21号，武运粳2845，盐稻11，盐丰2号，镇稻88，镇稻99，白香粳，02428，金农丝苗，糯稻，竹单5号，紫香糯，谷梅2号。Pi9的抗病对照材料为DX 60，Pi9的感病对照材料为日本晴，Pi-ta的抗病对照材料为DX 49，Pi-ta的抗病对照材料为新稻18。

1.2 DNA提取和引物

60份水稻品种及对照的种子在10 %的H2O2中浸泡10 min，冲洗3次，放入30 ℃的培养室中黑暗条件催芽，萌发后在泡沫孔板上播种，3叶期取叶片提取DNA。DNA提取采用改良的SDS方法。Pi9和Pi-ta的PCR特异性引物信息见王生轩等[11]。合成引物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 PCR扩增和电泳

PCR扩增体系为10.0μL，包括ddH2O 3.0μL、DNA模板1.0μL、10μmol/L引物1.0μL和5.0μL 2×Es Taq MasterMix(由Es Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂组成，由北京康为世纪生物科技有限公司提供)。扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，52 ℃(Pi9)或56 ℃(Pita)退火30 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。采用添加DNA green的1%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因PCR产物，紫外灯下观察，利用凝胶成像系统(Gel DocTM EZ imager，BIO-RAD)进行观察和拍照。

2 结果与分析

2.1 Pi9基因的标记检测

利用Pi9抗性基因的特异引物对60份黄淮稻区种植的水稻品种进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验(图1)。结果表明，原稻108、郑稻18、郑稻19、郑粳107、大粮203、越富、豫农粳12号、豫稻16等31个品种与抗性对照一样，扩增出1条约480 bp的特异条带，表明它们均含Pi9抗性基因(表1)；豫粳6号、豫农粳6号、郑稻1号等29个品种与感病品种一样，没有扩增出条带，表明它们不含Pi9基因。携带Pi9抗性基因占60份水稻品种的51.67%，说明Pi9已经在黄淮稻区水稻品种中广泛应用。

2.2 Pi-ta基因的标记检测

利用Pi-ta的特异引物对感病对照、抗病对照和60份水稻品种进行PCR检测(图2)。结果表明，豫粳6号、豫农粳6号、原稻108等51个品种与感病品种一样，扩增出1条约1 042 bp的特异条带，表明它们含Pi-ta感病基因序列，为Pi-ta感病材料(图2 A，表1)。郑稻18、豫农粳12号、豫稻16、南粳5055、农香粳、泰香2号、武香粳14号、武运粳21号、金农丝苗9个品种与抗性对照一样，扩增出1条约1 042 bp的特异条带，表明它们均含Pi-ta抗性基因，为Pi-ta抗性材料(图2 B，表1)。携带Pi-ta抗性基因占60份水稻品种的15.00%，说明Pi-ta基因在黄淮稻区水稻品种中还没有广泛应用。

注：A为感病基因检测结果；B为抗病基因检测结果；M为DM 2000；C 1为DX 49；C 2为新稻18；1～60见表1。图2 Pi-ta抗病基因PCR检测

表1 Pi9和Pi-ta基因在60个河南水稻品种中的分布

编号品种 Pi9Pi-ta编号品种 Pi9Pi-ta1豫粳6号--31淮稻8号+-2豫农粳6号--32淮稻9号+-3原稻108+-33津稻372+-4郑稻11号--34连粳10号+-5郑稻18++35连粳11号+-6郑稻19+-36南粳42--7郑稻1号--37南粳5055-+8郑稻4号--38南粳9108+-9郑稻5号--39宁粳3号+-10郑粳107+-40宁粳4号+-11大粮203+-41农香粳-+12菡科18--42圣稻16+-13越富+-43泰香2号++14豫农粳12号++44武香粳14号++15豫稻16++45武育糯16号--16旱稻277--46武育糯6号--17旱稻297+-47武运粳23--18旱稻502--48武运粳21号++19洛稻998--49武运粳2845+-20新旱2号--50盐稻11+-21郑旱2号+-51盐丰2号+-22郑旱6号--52镇稻88+-23郑旱9号--53镇稻99+-24郑旱10号--54白香粳+-25IRAT109--5502428--26丹东陆稻--56金农丝苗-+27秦爱--57糯稻--28台东陆稻--58竹单5号+-29红米--59紫香糯+-30淮稻6号+-60谷梅2号--

注：“+”表示携带抗性基因,“-”表示不携带抗性基因。

3 讨论与结论

稻瘟病是水稻三大主要病害之一，近年有逐年高发趋势，稻瘟病抗性育种已成为水稻育种家的首要工作[12]。传统的稻瘟病抗病基因分析，需要稻瘟病生理小种接种鉴定、抗病遗传分析大量的繁琐工作。随着稻瘟病抗病基因的不断定位、克隆和分子标记的开发，基于对抗病基因DNA序列进行标记筛选，选择效率和精准性均有大幅度提高[13]。已有研究证明，Pi9和Pi-ta基因分子标记在辅助选择育种中的应用价值[14-15]。本研究发现，Pi9和Pi-ta基因在黄淮稻区主要推广种植的60个水稻品种中都有利用，Pi9抗病基因利用较广泛，51.67%的材料都携带Pi9抗病基因；Pi-ta抗病基因利用的较少，只有15.00%的材料携带Pi-ta抗性基因。郑稻18、豫农粳12号、豫稻16、泰香2号、武香粳14号和武运粳21号共6个材料同时携带Pi9和Pi-ta2个稻瘟病抗病基因，占所有材料的10.00 %。显示黄淮稻区稻瘟病抗性利用还远远不够，尤其是抗病基因的聚合应用太少。利用单个抗稻瘟病基因进行抗病育种，单基因抗性品种种植2、3年后抗病性很容易流失，重新成为感病品种。因此，稻瘟病抗病育种要依靠抗性基因的遗传多样性，选择并聚合多个主效广谱稻瘟病基因来培育新品种[11]。携带Pi9和Pi-ta2个稻瘟病抗病基因的6个材料中，武香粳14号、豫稻16、泰香2号和豫农粳12号稻瘟病抗性较好，田间具有较高的丰产性，没有稻瘟病发病症状，是值得育种家利用的优良抗性资源。而武运粳21号稻瘟病接种鉴定为感穗颈瘟，郑稻18田间稻瘟病发病严重，表明稻瘟病抗性机制复杂，Pi9和Pi-ta并不能解释这些品种的稻瘟病抗性，还需要进一步的挖掘、鉴定更多的稻瘟病抗性基因，从而为稻瘟病育种利用奠定基础。