3种新型纳米粉末显现对潜指印中DNA分型的影响

喻彦林， 王旭东， 颜 磊

(1.西南政法大学刑事侦查学院， 重庆 401120； 2.重庆高校物证技术工程研究中心， 重庆 401120)

0 引言

指印历来被称为“证据之王”。刑事现场遗留的指印多为潜指印。粉末显现法操作简便、价格低廉、显现效果好，广泛适用于在光滑表面的潜指印的显现中，至今仍是刑事现场潜指印显现最为常用的方法之一。但由于传统显现粉末(如金粉、银粉、碳粉、磁粉等)的尺寸多为微米级，对于渗透性客体、粗糙表面则显现效果通常较差。随着纳米材料和纳米技术的不断发展，具有均一、超微尺寸的功能化纳米材料在潜指印的显现中受到了越来越多的关注[1]。CdTe量子点[2]、金属纳米颗粒(Au、Ag、Pt)[3-5]、碳点[6]等纳米材料[7-8]均已应用于潜指印的显现中。这些纳米材料显现不仅可以显现清晰的指印一级特征、二级特征，而且可清晰显现指印的三级特征；尤其是对于粗糙表面上的潜指印，其显现效果显著优于传统粉末的显现效果，已经获得了商品化应用。

DNA分析是目前刑事技术中个体认定最为强有力的工具之一。随着DNA的高灵敏提取技术的发展，指印接触DNA(Touch-DNA)分型成功率大幅提高，尤其是对于现场模糊指印，DNA分析在遗留人认定中具有决定性的作用，已成为近年来刑事现场的应用热点。

刑事现场潜指印的显现过程是否影响后续DNA分型？研究表明，化学显现方法对指印DNA分型存在不同程度影响; 而通常认为粉末法等物理显现方法对指印物质、指印载体损害较小，有利于后续的DNA分型[9]。但由于纳米材料具有不同于常规粉末的独特理化性质，新型纳米粉末显现指印对DNA分型的影响尚待进一步研究。

本研究组先后发展了基于微波辐射的快速制备Fe3O4磁性纳米粉末[10]、金纳米- 蒙脱土复合荧光粉末[11-12]、碳量子点- 蒙脱土复合荧光粉末[6]的纳米粉末/复合物，均具备简便快捷、环境友好、对人体无害、有强烈荧光/磁性等功能性优势，应用于多种载体上潜指印的显现，取得了理想效果。本文详细考察了上述3种不同纳米粉末显现前后对指印中残留DNA分析的影响。

1 实验部分

1.1 纳米粉末的制备

实验中所用的纳米及其复合物粉末均为自制。Fe3O4磁性纳米粉末制备的简要步骤如下[10]：取0.278 g FeSO4·7H2O溶解于50.0 mL超纯水中，浓氨水调节pH值为11.0后，置于微波高火加热数分钟，永磁体作用下分离、收集沉淀并水洗至中性，真空干燥后备用。制备的Fe3O4的典型尺寸为80 nm，具备明显磁性。

碳量子点(CD)荧光粉末制备[6]：称取2.0 g柠檬酸和0.2 g L-半胱氨酸，溶于10 mL超纯水，微波炉中高火微波加热5 min。将产物加入5 mL超纯水溶解，得到黄色透明的溶液。取上述溶液1.0 mL，加入0.25 g蒙脱土，混匀后在室温静置2 h。离心除去清液后烘干沉淀，即得到具有强烈荧光的碳量子点- 蒙脱土纳米复合物。

金纳米团簇(AuNC)荧光粉末制备[11]：在1.0 mL 10 mmol/L氯金酸溶液中依次加入1.0 mL 65mg/L BSA溶液、0.1 mL 1.0 mol/L氢氧化钠溶液，混合均匀后置于聚四氟乙烯的高压消解罐中，微波30 s，得到深棕色、具有强烈红色荧光的溶液。在上述产物中加入0.25 g蒙脱土，混匀后磁力搅拌0.5 h，离心除去清液，真空干燥沉淀，即得到具有强烈红色荧光的金纳米团簇- 蒙脱土纳米复合物。

1.2 潜指印的遗留与显现

所有用于提取指印中DNA的材料均经过清洗与消毒。载玻片(帆船牌，76 mm×25 mm，厚度1.0～1.2 mm)依次采用洗涤剂、超纯水、乙醇清洗后自然晾干，并紫外消毒30 min。镊子、剪刀均经紫外消毒。

3名志愿者(2男1女)均在肥皂洗手后一小时提取指印。捺印前摩擦左右手以减少左右手差异，分别以左右手拇指、食指、中指、环指分别在不同载玻片上轻触遗留指印。每名自愿者遗留20枚指印，其中15枚(每组5枚)采用制备的3种纳米粉末显现指印后提取DNA，5枚未经显现直接提取DNA(对照组)，另取未遗留指印的载玻片作为空白对照。为避免指印显现过程中指纹刷可能带来污染[13]，采用“抖显法”进行显现。

1.3 DNA提取

采用“生物物证提取专用棉签”(北京佰优意诺科技有限公司)蘸取无菌水擦拭指印(或空白对照)后，采用D-盾超敏DNA提取试剂盒(II型，上海惠文生物技术有限公司)并按照试剂盒操作说明进行提取。主要步骤如下：1)将擦拭后的棉签拭子转移入离心套管，加入裂解液160 μL，56 ℃裂解25 min，99 ℃裂解10 min；2)13 000 g离心10 s，加入吸附液200 μL，13 000 g离心(eppendorf 5415D)2 min，除去套管后加入吸附液950 μL，混匀后加入吸附珠16 μL，静止15 min；3)8 000 g离心30 s，除去上清液，加入漂洗液750 μL，混匀；4)8 000 g离心30 s，除去漂洗液，56 ℃烘干吸附珠；5)加入漂洗液30，混匀，56 ℃温育15 min后备检。

1.4 PCR扩增与电泳分析

采用GeneAmp PCR System 9700(AB公司，美国)扩增仪和STRtyper-21G Plus复合扩增系统 (海尔施,宁波)进行扩增；反应体系为25 μL。反应条件为95 ℃11 min; 94 ℃20 s, 59 ℃3 min,共30个循环; 60 ℃10 min。PCR扩增产物采用ABI 3500型基因分析仪(AB公司, 美国)进行毛细管电泳,用Gene Mappe ID-X软件(AB公司, 美国)分析STR基因型。数据统计与分析采用Graphpad Prism 6.0(Graphpad Sofrware，美国)进行。

2 结果与讨论

2.1 分型结果

实验结果显示，空白对照中未检出DNA，表明实验区域未受污染。指印提取物的典型电泳谱图见图1。由于DNA含量低，多数指印未能对所有基因座准确分型，部分等位基因出现了明显的不对称扩增。

为了考察不同粉末显现对DNA分型的影响，本实验共对3名志愿者遗留的60枚指印中DNA进行了分型，分型结果见图2。实验中的3个空白对照中均未检出DNA，表明实验区域未受污染；志愿者1所留的各组指印中均检出DNA，检出位点数均高于15个；而志愿者2所留指印中DNA分型成功率较低，仅11枚显现后的指印中检出11个以上的基因座；志愿者3所留的15枚指印中的14枚检出11个以上的基因座。3名志愿者之间指印中位点检出率差异明显，体现了个体差异的显著影响[14-15]。

图1 显现后指印中提取的DNA的典型电泳图

2.2 不同显现方法对STR分型结果的影响

由图2可知，同一志愿者遗留的指印中，对照组(未显现组)与Fe3O4显现组、CD显现组、AuNC显现组无明显差异。为了进一步定量评估显现组与对照组差异的显著性，本文采用t检验方法(Student’st-test，表1进行分析。结果显示，所有显现组与对应对照组的P值均远大于0.05，表明所有显现组与未显现组STR分型成功率均无显著差异。

Fe3O4纳米粉末、Au-NCs@MMT、C-Dots@MMT显现潜指印的原理均为与指印物质的静电相互作用，其显现过程与指印残留物未发生化学键合；上述3种粉末中的纳米材料及蒙脱土载体均为环境友好试剂，不会导致指印中的DNA降解。本实验采取的DNA提取方法基于吸附珠对DNA的选择性结合，Fe3O4粉末、蒙脱土难以溶于水，Au-NCs、C-Dots与吸附珠无明显特异性结合，在清洗过程中也已有效去除。因此，本实验证实的所有显现组与控制组基因座检出率均无显著差异，是合理的。上述结果与文献报道的对其他物理显现方法及部分化学显现方法的评价结果一致[7]。

图2 纳米粉末显现组与对照组检出位点数比较

DonorP value (vs Untreated)Fe3O4Au-NCsC-Dots10.5573>0.99990.346620.62060.78850.928030.88500.87430.8062

3 结语

Fe3O4纳米粉末、碳量子点、金纳米团簇及其复合物不仅无毒无害，而且具有强烈荧光、磁性功能性优势，用于潜指印显现，相对于传统粉末具有一定优越性。本文通过比较Fe3O4纳米粉末、碳量子点- 蒙脱土复合粉末、金纳米团簇- 蒙脱土复合粉末3种自制纳米粉末显现的指印与未显现组指印中DNA提取及分型结果，发现3种纳米粉末显现过程对指印中DNA分型无显著影响，对纳米粉末在指印显现中的应用具有指导意义。