不同产地诺丽发酵汁功效成分分析及评价

周偏，梁丛颖，乌日娜，蔡坤，刘四新，李从发，*

（1.海南大学食品学院，海南海口570228；2.海南大学材料与化工学院，海南海口570228）

诺丽（Noni，Morinda citrifolia Linn），又称海巴戟、海巴戟天，属茜草科海巴戟天属药用植物，主要分布在南太平洋诸岛屿、澳大利亚、东南亚，以及我国的部分海域[1]。在波利尼西亚，诺丽作为传统的保健食品和药品已有2 000多年的历史[2]。诺丽含有丰富的生物活性成分，包括多糖、生物碱、环烯醚萜、蒽醌、东莨菪素、糖苷类化合物、维生素和矿物质等[3-5]。现代研究显示诺丽具有抗血栓、降血糖、抗菌活性，以及清除自由基，调节胆固醇，刺激免疫系统，调节细胞功能和净化血液等多种功能，对癌症、糖尿病、高血压和痛风等多种疾病有较好的预防和治疗作用[6-8]。1943年，美国将诺丽认定为可食用植物资源；2002年，欧盟认定诺丽果汁为一种新资源食品；2010年，中国卫生部批准诺丽果浆为新资源食品。目前投放市场的诺丽产品种类繁多，主要有诺丽发酵汁（诺丽酵素）、鲜榨汁、果粉以及果茶等，其中以诺丽发酵汁最为畅销，保健功效性也宣称最佳。当前国内外诸多诺丽加工企业对诺丽发酵汁的生产工艺以传统自然发酵为主，将果装入密封罐或桶中避光自然发酵（时间为二个月至一年不等），随着发酵的进行，果汁从果肉中自然渗出，渗出的发酵汁颜色由浅褐色渐渐变深，最终呈深褐色，过滤后即得诺丽发酵汁[9]。由于诺丽发酵汁在生产过程中缺乏官方标准的质量控制程序和评价体系，所以通常区分高质量和低质量的诺丽发酵汁是困难的[10]。2007年，Potterat等[11]报道了可用于诺丽产品质量控制的定量高效液相色谱-质谱联用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS） 分析方法，确定了东莨菪素、环烯醚萜、蒽醌和3-甲基-1，3-丁二醇作为诺丽发酵汁的典型标记特征化合物。2011年，Basar和 Westendorf[12]确定了基于测定 2E，4Z，7Z-癸三烯酸（2E，4Z，7Z-decatrienoic acid，DTA），东莨菪素和钾3种标记化合物的诺丽发酵汁质量评价的方法，使用此方法，可以简单区分诺丽果汁有或没有发酵步骤。

目前市场上诺丽发酵汁产地、品牌繁多，不同产地诺丽发酵汁的风味、颜色深浅各不相同。对其主要成分和活性物质的测定仅仅局限于单个地区，地区间的营养和活性成分的比较还鲜有报道。随着诺丽发酵汁较高的营养、药用和经济价值逐渐被人们认识，需求量将逐渐增大。为此，本研究通过测定国内外6个不同产地诺丽发酵汁的主要营养成分和活性物质含量，并通过主成分分析对其进行评价，寻找诺丽发酵汁产地间的营养活性成分差别，了解不同地区、种植环境和生产技术等因素对诺丽发酵汁品质的影响，以期为诺丽发酵汁的质量分析、品质评价及其产品合理选择提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

诺丽发酵汁均为商业市售，分别选自斐济、新西兰、泰国、大溪地、海南海口和海南万宁6个原产地，样品编号分别为：FJ、NZ、TL、DXD、HNH、HNW。

牛血清白蛋白标准品（纯度＞98%）、考马斯亮蓝、福林酚：北京索莱宝科技有限公司；没食子酸标准品（纯度＞98%）、芦丁标准品（纯度＞98%）、东莨菪素标准品（纯度＞98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2’-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2，2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）：美国 Sigma公司；去乙酰车业草苷酸标准品：武汉天植生物技术有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PB303-N电子精密天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DK-98-1电热恒温水浴锅：天津泰斯特仪器有限公司；TG16-WS高速离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；3B-5200-DTD超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；Agilent1260高效液相色谱仪：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 营养成分的测定

总酸含量测定：参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》，以乙酸计量；蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝方法[13]测定，通过牛血清白蛋白标准曲线回归方程（y=0.020 7x+0.054 2，相关系数 R2=0.998 3）计算；还原糖含量测定：采用 3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）显色法[14]测定，通过葡萄糖标准曲线回归方程（y=0.993 2x-0.008 7，相关系数R2=0.999 7）计算；总酚含量的测定：采用福林酚（Folin-Ciocalteu，FC）比色法[15]测定，通过没食子酸标准曲线回归方程（y=0.103 7x+0.015 2，相关系数 R2=0.998 9）计算；总黄酮含量的测定：采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[16]测定，通过芦丁标准曲线回归方程（y=0.007 1x-0.025 5，相关系数为R2=0.998 6）计算。

1.3.2 体外抗氧化活性的测定

DPPH·清除能力测定：参考MISHRA K等[17]的方法测定，以DPPH·清除率表示；ABTS+·清除能力测定：参考RE R等[18]的方法测定，以ABTS+·清除率表示；·OH清除能力测定：参考张伟敏等[19]的方法测定，以·OH自由基清除率表示；总还原力能力测定：参考OYAIZU M等[20]的方法测定，以吸光值表示。自由基清除率公式：

式中：Ai为待测夜在测定波长时的样品吸光值；Aj为测定液在测定波长时的空白吸光值；Ac为未加测定液时模型的吸光值。

1.3.3 有机酸含量的测定

参照Sabokbar等[21]的方法稍作改进，采用液相色谱仪测定诺丽发酵汁中的有机酸含量。色谱条件：液相色谱仪：安捷伦1260，配有紫外检测仪；色谱柱：安捷伦 Zorbax SB－aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.02 mol/L磷酸二氢钾（pH=2.5）∶甲醇=98∶2（体积比）；柱温 30 ℃；流速 0.5 mL/min；进样量 10 μL；波长210 nm；等度洗脱40 min。

1.3.4 活性物质的测定

东莨菪素测定：参照谢婷[22]的方法稍加改进，采用安捷伦1260液相色谱仪进行测定。色谱条件：色谱柱：Zorbax SB－aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 ∶乙酸水溶液（0.1%）=30∶70（体积比）；柱温：35℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；紫外检测波长：346 nm；等度洗脱20 min。

去乙酰车叶草苷酸测定：参照陈建国等[23]的方法稍加改进，采用安捷伦1260液相色谱仪进行测定。色谱条件：色谱柱：Zorbax SB－aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A：0.1%磷酸水溶液，B：乙腈；梯度洗脱：0～10 min 4%B；10 min～22 min 15%B；22 min～40 min 4%B。流速：0.5 mL/min；柱温：35℃；紫外检测波长：237nm；进样量：10 μL；梯度洗脱 40 min。

1.3.5 统计分析

试验数据均是3次重复试验的平均值，结果表示为平均值±标准偏差（Mean±SD）。应用SPSS 24.0软件进行Duncan’s组间差异显著性统计和主成分分析（P＜0.05）。主成分分析（principal component analysis，PCA）时，以6个样品中19个指标因子的定量结果组成6行19列矩阵，数据经标准化处理后进行分析，以累计贡献率达95%以上来确定主成分的个数，同时将提取的主成分根据公式∑λiui（λ：主成分贡献率，u：各样品主成分值，i：1～4）计算各样品的综合得分。采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同产地诺丽发酵汁营养成分分析

不同产地诺丽发酵汁的营养成分测定结果见表1。

表1 不同产地诺丽发酵汁营养成分含量Table 1 The contents of the nutritional ingredients in fermented noni juice from different regions

由表1可知，不同产地诺丽发酵汁中各项营养成分指标具有明显的差异。不同产地诺丽发酵汁的总酸含量介于7.176g/L～13.728g/L之间，TL诺丽发酵汁的总酸含量（13.728 g/L）显著高于其他产地（P＜0.05），最低为海南海口产地（HNH），其总酸含量为7.167g/L，总酸含量高于10 g/L的产地仅有TL和海口万宁产地（HNW）；不同产地诺丽发酵汁的蛋白质含量普遍较低，介于0.063mg/mL～0.230 mg/mL之间，斐济产地（FJ）的蛋白质含量最高为0.230mg/mL，与新西兰产地（NZ）和HNH没有统计学上差异（P＞0.05），TL 的蛋白质含量最低，为 0.063 mg/mL；不同产地诺丽发酵汁中还原糖含量较为丰富，其含量在34.935mg/mL～89.979mg/mL之间，其中NZ的还原糖含量（89.979mg/mL）显著高于其他产地（P＜0.05），是HNW发酵汁含量（34.935 mg/mL）的2.5倍之多；不同产地诺丽发酵汁中总酚和总黄酮含量差异显著（P＜0.05），总酚含量介于0.790 mg/mL～1.262 mg/mL之间，总黄酮含量在0.377 mg/mL～0.833 mg/mL之间。其中NZ发酵汁的总酚和总黄酮含量最高，分别为1.262 mg/mL和0.833 mg/mL，显著高于其他产地（P＜0.05），总酚含量最低为HNH发酵汁（0.790 mg/mL），总黄酮含量最低的为TL发酵汁（0.377 mg/mL）。李晓花等[24]对泰国、海南和西双版纳3个产地诺丽干果的主要营养成分、矿物质和氨基酸的含量进行了分析和比较，发现不同产地中营养成分含量差别较大，且不具规律性，从营养成分角度考虑，海南和西双版纳均适宜诺丽的种植。程池等[16]比较了我国西沙与大溪地产地的诺丽发酵汁总黄酮含量，发现西沙诺丽果汁中总黄酮含量范围为0.250 mg/mL～0.301 mg/mL，平均含量为 0.274 mg/mL，与大溪地诺丽果汁无明显差异（平均含量为0.223mg/mL）。说明可能由于不同产地土壤、气候等生长条件有所差异，导致诺丽发酵汁营养成分差异性较大。

2.2 不同产地诺丽发酵汁抗氧化活性分析

不同的抗氧化化合物可能通过不同的作用机制与氧化剂发生反应，一个孤立的方法很难全面评估抗氧化剂的抗氧化能力，通常采用多种评价体系来衡量抗氧化特征[25－26]。因此，通过测定清除 DPPH·、ABTS+·、·OH能力和总还原力4种抗氧化活性体系来评价不同产地诺丽发酵汁的抗氧化能力，结果如表2所示。

表2 不同产地诺丽发酵汁的抗氧化活性Table 2 The antioxidant activity of fermented noni juice from different regions

由表2可知，不同产地诺丽发酵汁均显示出不同程度的自由基清除能力和还原能力。不同产地诺丽发酵汁对不同自由基的清除能力和还原力上显著差异（P＜0.05）。NZ和FJ在清除DPPH·能力上最强，清除率分别为67.536%、65.842%。而TL的DPPH·清除率最低（38.362%）。类似的，NZ在清除ABTS+·能力上依然保持较好的抗氧化性能，清除率高达77.594%，显著高于其他产地样品（P＜0.05）。各产地诺丽发酵汁对·OH清除能力与DPPH·清除能力相一致，清除率由大到小依次为：NZ（DPPH·：67.536%，·OH：51.534%）＞ FJ（DPPH·：65.854%，·OH：47.516%）＞DXD（DPPH·：57.894%，·OH：46.363%）＞ HNW（DPPH·：46.355%，·OH：44.642%）＞HNH （DPPH·：44.528%，·OH：40.989%）＞TL（DPPH·：38.362%，·OH：35.662%）。总还原能力的强弱以吸光度值的大小衡量，吸光度值越大表示还原能力越强。FJ和NZ产地的诺丽发酵汁总还原能力较强，吸光值为0.470和0.462，其次为HNH（0.376）和 DXD（0.356），HNW 和 TL 还原能力相对较弱（HNW：0.266，TL：0.254）。结果表明，诺丽发酵汁对各自由基具有较强的清除能力以及良好的还原能力。不同产地的诺丽发酵汁其抗氧化活性存在一定程度的差异。新西兰（TL）和斐济（FJ）的两种产地诺丽发酵汁表现最好。

2.3 不同产地诺丽发酵汁有机酸含量分析

有机酸是发酵汁中主要的风味营养物质，其含量高低与发酵汁制品的品质有密切的关系。此外，发酵汁中的有机酸还可促进消化腺的活动，有助于食物的吸收，具有开胃和促进消化的作用[27]。通过高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对不同产地诺丽发酵汁的8种有机酸含量测定，结果见表3。

由表3可知，8种有机酸在所有产地诺丽发酵汁样品中均有检出。各产地诺丽发酵汁中的有机酸含量存在一定的差异和相似性，各样品有机酸总含量在22.238 mg/mL～35.286 mg/mL之间，其中TL发酵汁有机酸含量最高达到35.286 mg/mL，其次为NZ（27.660 mg/mL），HNH和HNW发酵汁有机酸总量相近，分别为30.357、29.664 mg/mL，FJ和DXD发酵汁含量较低，分别为23.058、22.238 mg/mL。在所有样品中，8种有机酸在各产地的诺丽发酵汁中组成含量相似，均以半乳糖醛酸含量最高，其次为苹果酸、乳酸、乙酸和琥珀酸，酒石酸和柠檬酸含量较低，而延胡索酸含量微乎其微。TL发酵汁半乳糖醛酸含量最高，占其有机酸酸总量的75.874%，其次为乙酸（6.029 mg/mL），占总量的17.286%；NZ发酵汁中半乳糖醛酸含量为13.473 mg/mL，占总量的48.709%，苹果酸、乳酸和琥珀酸含量次之，分别占总量的18.232%、15.651%和12.343%。FJ发酵汁中半乳糖醛酸、苹果酸和琥珀酸含量较高，分别占总量的45.693%、25.098%和18.150%。HNH和HNW中有机酸组成含量相似，半乳糖醛酸、乳酸和琥珀酸含量较高。DXD发酵汁中半乳糖醛酸、琥珀酸和乙酸较高，分别占总量的76.266%、12.303%和6.813%，乳酸含量相比其他产地含量较低。

表3 不同产地诺丽发酵汁有机酸含量Table 3 The contents of organic acid in fermented noni juice from different regions mg/mL

续表3 不同产地诺丽发酵汁有机酸含量Continue table 3 The contents of organic acid in fermented noni juice from different regions mg/mL

2.4 不同产地诺丽发酵汁活性物质分析

诺丽中富含多种生物活性化合物，东莨菪素和去乙酰车业草苷酸是诺丽中两种主要的活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗畸变和降血脂等功能[28－29]。通过HPLC对不同产地诺丽发酵汁中两种活性物质含量进行了测定，测定结果见图1。

图1 不同产地诺丽发酵汁中活性物质含量Fig.1 The contents of active substances in fermented noni juice from different regions

由图1可知，各样品中去乙酰车业草苷酸含量高于东莨菪素，不同产地发酵汁中东莨菪素和去乙酰车业草苷酸含量差异显著（P＜0.05）。NZ发酵汁中东莨菪素含量最高，达到76.873 μg/mL，显著高于其他产地（P＜0.05），其次为 FJ（56.468 μg/mL）、HNH（28.451 μg/mL）、HNW（27.239 μg/mL）和 TL（13.097 μg/mL），DXD 含量最低（11.203 μg/mL）；FJ发酵汁中去乙酰车业草苷酸含量最高，达到1.235 mg/mL，显著高于其他产地（P＜0.05），其次为 NZ（1.167 mg/mL），HNH（0.785 mg/mL）、HNW（0.592 mg/mL）和 DXD（0.325 mg/mL），TL 含量最低（0.121 mg/mL）。总体上，在两种活性成分方面，NZ和FJ产地均优于其他4种产地，其次为HNH和HNW，而DXD和TL差之。Potterat等[11]采用薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）标记鉴定及 HPLCMS定量分析比较不同产地8种商业诺丽发酵汁中东莨菪素和去乙酰车业草苷酸含量，发现东莨菪素含量在未检出到0.023 mg/mL之间，去乙酰车业草苷酸在0.23 mg/mL～2.42 mg/mL之间，其斐济产地两者含量均高于大溪地和泰国产地，这与我们结论相一致。

2.5 不同产地诺丽发酵汁各指标的主成分分析

诺丽发酵汁品质的构成因子较多，不同品质因子之间存在着密切相关性和相对独立性。为综合评价不同产地诺丽发酵汁的营养成分和活性物质差异，对已测定的营养成分、抗氧化活性、有机酸和活性物质共19个因子在构建6行×19列矩阵的基础上进行主成分分析（principal component analysis，PCA），将各指标因子进行无量纲标准化处理后，求得的相关系数矩阵，根据累计方差贡献率大于95%的原则提取了4个主成分。其中不同产地诺丽发酵汁的主成分1与主成分2因子载荷图如图2所示。由图2可知，第一主成分的贡献率为39.116%，而第二主成分的贡献率为23.285%，两者总和贡献率为62.401%，表明前两主成分并未能完全体现诺丽发酵汁中全部信息，而提取的前四个主成分的详细载荷矩阵如表4所示。

图2 不同产地诺丽发酵汁的主成分1（PC1）与主成分2（PC2）因子载荷图Fig.2 Graphical representation of the principal component analysis of fermented noni juice from different regions showing PC1 vs PC2：factor loading

表4 主成分因子载荷矩阵Table 4 Component load matrix after principal component analysis

由表4可知，前4个主成分的特征值分别为7.432、4.424、3.775和3.062，累积方差贡献率达98.386%，说明前4个主成分基本能够客观反映诺丽发酵汁各指标信息。决定第1主成分（PC1）大小的主要是总酸、蛋白质和乙酸；决定第2主成分（PC2）大小的主要是总酚、·OH和DPPH自由基清除率；决定第3主成分（PC3）大小的主要是去乙酰车业草苷酸、东莨菪素和苹果酸；决定第4主成分（PC4）大小的主要是乳酸和还原糖。

2.6 不同产地诺丽发酵汁品质综合评价

通过累计方差贡献率提取的4个主成分为综合评价的指标，计算得到不同产地诺丽发酵汁的主成分得分及综合得分见表5。

表5 不同产地诺丽发酵汁的主成分得分及综合排序Table 5 Factor scores and comprehensive ranking of fermented noni juice from different regions

由表5可知，FJ和NZ诺丽发酵汁分别排第一和第二，其次为HNH、DXD和HNW，TL综合得分最低。

在目前诺丽发酵汁营养成分和活性物质的评价方法和指标体系尚没有确定的背景下，借鉴其他食品种类[30-32]的数学分析方法，主成分分析为评价诺丽发酵汁营养质量指标提供一定的技术分析支撑，以期对只依据部分活性物质来评价诺丽发酵汁品质的方法提供了一条新的思路。

3 结论

本研究对国内外6个不同产地的诺丽发酵汁的营养成分和活性物质进行分析与评价。结果表明，诺丽发酵汁的营养成分、抗氧化活性、有机酸和活性物质等指标均呈现明显的产地差异性。在营养成分方面，TL总酸含量显著高于与其他产地。NZ还原糖、总酚和总黄酮含量均高于其他产地。在抗氧化活性方面，NZ的自由基清除能力均优于其他产地，FJ在还原能力上表现最好。6个产地的诺丽发酵汁均检出8种有机酸且各有机酸含量差异明显。各产地诺丽发酵汁有机酸组成中均以半乳糖醛酸含量最高，延胡索酸含量最低，在总量上，以TL为最高，这与总酸含量相吻合。在活性物质方面，NZ和FJ的东莨菪素和去乙酰车业草苷酸含量均高于其他4种产地。通过主成分分析发现，FJ综合品质评价评分最高，其次为NZ，表明其综合营养品质较为优良，而TL得分较低。