舒筋祛痹汤对腰椎间盘突出症大鼠PLA2活性、IL-6、TNF-α水平和椎间盘退变的影响

王裕祥 ，杨应忠 ，秦卫春 ，王卫东 ，张莹

（1.西宁市第二人民医院骨科，青海 西宁 810003；2.青海大学高原医学实验室；3.青海省中医院；4.西宁市中医院）

近年来，腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，LDH）的患病率不断增长，炎症介质在神经根病变导致的LDH中起着至关重要的作用，如肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1（Interleukins-1，IL-1）、IL-6 等。而早在上世纪九十年代国外学者Ozaktay等[1]通过实验在兔子腰关节囊、附近组织中注入磷脂酶A2（Phospholipase A2，PLA2），解剖后证实了在突出椎间盘髓核中PLA2具有高度引起局部炎症的特性。本实验通过观察舒筋祛痹汤对大鼠LDH模型髓核中PLA2活性及血清IL-6、TNF-α及椎间盘退变的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取3月龄清洁级SD雄性大鼠60只，体质量（240±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供（许可证号为SCSK（京）2001-0001）；每笼5只，分笼适应性喂养5 d，环境控制：温度约22℃，湿度约65%。采用随机数字表法将60只雄性大鼠均分为正常组、模型组、给药组，每组20只。除正常组大鼠正常环境下继续饲养以外，西医组、中医组建立LDH大鼠模型。

1.2 药物与试剂 中药舒筋袪痹汤方药组成：当归、丹参各20 g，独活、威灵仙、鸡血藤各15 g，桃仁、红花、川芎、青风藤、海风藤各10 g，制川乌、制草乌各6 g；购自北京同仁堂药店，鉴定为正品；加冷水500 mL，浸泡30 min后煮沸，并按临床方法制备药液，浓缩至200 mL，含生药4.5 g/mL，临用前用蒸馏水稀释至所需浓度即可。双氯芬酸钠肠溶片（国药准字H41022703，批号100813，南阳普康药业有限公司）；青霉素钾（国药准字H12021126，批号030325，天津南华制药有限公司）；碘伏溶液（国药准字H52020884，批号100916，遵义华卫制药有限公司）；硫化钠溶液（国药准字H21022984，批号100930，辽宁天龙药业有限公司）；大鼠IL-6、TNF-α ELISA测定试剂盒（北京瑞格博科技有限公司）。

1.3 制备模型 大鼠双前肢剪毛，常规清洁处理后以碘伏消毒上肢皮肤。以8%硫化钠溶液去掉大鼠背部被毛，次日腹腔注射10%水合氯醛2 mL/kg完成麻醉。参考文献[2]建立LDH大鼠模型：于尾根部切断尾椎（距肛门约1 cm），取出尾椎的一个髓核及椎间盘周围软组织后常规缝合伤口。以L5棘突为中心取背部正中纵行切口，沿棘突两侧剥离骶棘肌并向两侧分开，显露双侧L4、L5椎板，咬除其对应棘突及右侧椎板，将之前取出的自体尾椎髓核轻轻放于硬膜外腔对应L4-L5神经根位置，操作时避免对脊髓、神经根造成勿压，最后缝合伤口。待大鼠麻醉苏醒后，饲养笼喂养3 d，期间腹腔注射青霉素80000 U预防感染并促进尾部伤口快速收口结痂；于7 d后行X线摄片检查，腹腔注射10%水合氯醛（40 mg/kg）麻醉，使用高分辨率数字小动物X线机行腰椎侧位片检查，若X线片提示模型大鼠下腰椎间隙变窄且椎体前缘出现唇缘样增生，则制模成功。

1.4 分组与给药正常组大鼠正常环境下下饲养；西医组大鼠给予双氯芬酸钠肠溶片连续灌胃给药14 d，以成人公斤体重的每日临床用药剂量为参考，以人鼠比例单位体重所占体表面积的比值进行换算后计算最终剂量；中医组大鼠给予舒筋袪痹汤进行灌胃给药14 d，折合生药2.5 g/d。

1.5 观察指标

1.5.1 髓核中PLA2活性 于制模后3、7、14 d各组分别取6个移植髓核标本保存于-80℃冰箱。样本在60℃水浴30 min后冷却，置4℃冰箱备用，取2只25 mL烧杯分别作为A管和B管。B管加入8 mL底物缓冲液，1.1 mL乙二胺四乙酸，样本0.4 mL；8 mL A管加入底物缓冲液，0.2 mL CaCl2溶液，样本0.4 mL。37℃水浴后，B管加入0.2 mL CaCl2溶液，A管再加入1.1 mL乙二胺四乙酸，混匀后以高灵敏度pH计测量A管、B管的pH值，以微量吸枪吸取新标定的稀盐酸将B管的pH滴定至与A管的相同的pH值，PLA2的活力通过所消耗的盐酸测定：1个PLA2活性单位规定为在37℃下，每分钟每毫升样本反应消耗1 nmol盐酸。PLA2（U）=所消耗盐酸浓度（mol/L）×体积（mL）×106×2.5/反应时间（min）。

1.5.2 血清IL-6、TNF-α测定 于制模后第14天将各组大鼠分别固定于铡刀，在枕骨大孔水平断头处死。各组大鼠均采用断头后迅速倒置，离心管收集全血5 mL，4℃下静置3 h，3000 r/min离心机内离心处理15 min，取上清于-20℃冰箱保存待测。采用双抗夹心ELISA法测定血清IL-6、TNF-α浓度。

1.5.3 神经根组织形态学观察 断头处死大鼠后，从腹腔解剖入路暴露L5神经根，取长约2 mm的神经根组织，以10%甲醛浸泡固定，4℃冰箱保存。切片观察：自神经根组织分叉近端开始切片，厚度5 μm，然后实施常规脱蜡、H-E染色、脱水、中性树脂封片，最后光学显微镜下观察神经根组织的病理改变。

1.6 统计学方法 研究数据选用统计学软件SPSS 19.0分析和处理，计数资料采取率（%）表示，对比进行 χ2检验；计量资料采取（±s）表示，进行独立 t检验，以P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 PLA2活性比较 制模成功经大鼠灌胃后第3天，中药组、西药组大鼠髓核组织中PLA2活性达到最高，均显著高于正常组（P＜0.05）；此时中药组髓核组织中PLA2活性略高于西药组，但差异无显著性（P＞0.05）。第7、14天中药组、西药组髓核组织中的PLA2活性均显著较第 3天降低（P＜0.05），且第 7、14天中药组髓核组织中PLA2活性均略低于西药组，但差异无显著性（P＞0.05）。见表1。

表1 三组大鼠髓核组织中PLA2活性比较（±s，ng/mL）

表1 三组大鼠髓核组织中PLA2活性比较（±s，ng/mL）

注：表中正常组未制模，饲养同时段为数据；与同组制模后第3天比较，△P＜0.05；与正常组比较，▲P＜0.05。

组别 n 制模后第3天 制模后第7天 制模后第14天正常组 20 25.86±4.42 24.41±4.72 24.62±4.14西药组 20 48.66±7.50▲ 39.12±7.13△▲ 34.11±6.49△▲中药组 20 50.92±8.71▲ 37.97±7.34△▲ 32.30±6.97△▲

2.2 IL-6、TNF-α浓度比较 制模成功经大鼠灌胃后第14天，西药组、中药组血清IL-6、TNF-α浓度略高于正常组，但差异无显著性（P＞0.05）；且中药组血清IL-6、TNF-α浓度略低于西药组，但差异无显著性（P＞0.05）。见表2。

表2 三组大鼠血清IL-6、TNF-α 浓度比较（±s）

表2 三组大鼠血清IL-6、TNF-α 浓度比较（±s）

组别 n IL-6（ng/L） TNF-α（ng/L）正常组 20 12.35±2.70 78.86±7.42西药组 20 14.03±3.15 82.65±7.50中药组 20 13.57±2.66 80.92±7.71

2.3 三组大鼠神经根组织形态学比较 正常组大鼠神经组织结构致密、完整，有髓纤维的髓鞘完整、排列规则整齐，雪旺细胞数量多、大小均匀，轴突表面规则完整、无水肿。中药组出现新生的髓鞘，排列较规则，雪旺细胞大小基本一致，轴突排列整齐、无水肿；但西药组髓纤维新生的髓鞘不完整，排列欠规则，雪旺细胞数量较少，且轴突边缘不清晰，大小不均，仍可见轻度水肿变形，胞质内可见空泡。见图1。

3 讨 论

中医学认为LDH患者慢性腰腿疼痛多与“正气亏虚，经脉痹阻，经筋失衡，气血失和”有关，内伤劳损、外感及跌仆损伤致腰部筋脉受损、瘀血阻络、经脉痹阻，加之气血运行不畅致脏腑功能、关节不利，不通则痛[3]。故《三因极一病证方论·腰痛病论》有“夫腰痛属肾虚，亦涉三因所致；在外则脏腑经络受邪，在内则忧思恐怒，以至房劳堕坠，皆能使痛”的描述。舒筋袪痹汤基于LDH的中医病因病机拟定，方中当归、丹参、桃仁、红花、川芎、鸡血藤等可舒筋活络、消肿止痛，青风藤、海风藤、制川乌、制草乌、独活、威灵仙等可散寒逐痹、抗炎镇痛。现代药理学研究证实，舒筋袪痹汤治疗LDH，一方面具有改善组织微循环和血液流变性，降低毛细血管通透性和脆性的作用，从而可有效减少损伤局部的组织液外渗；另一方面可改善神经血液微循环，促进炎症因子及致痛因子的代谢，缓解腰腿痛症状[4-5]。

图1 三组大鼠右侧L5神经根组织形态学观察示例（×400）

为进一步探究舒筋袪痹汤治疗LDH的临床效果，本实验制作LDH大鼠模型，制模成功后，中药组给予舒筋袪痹汤经大鼠灌胃，并与西药组、正常组大鼠相比较，发现灌胃后第3天，中药组、西药组大鼠髓核组织中PLA2活性达到最高，均显著高于正常组；此时中药组髓核组织中PLA2活性略高于西药组，差异无显著性，说明在第3天两组都可以对髓核组织中的PLA2活性起到抑制作用，但中药组不如西药组明显。在第7、14天，中药组、西药组髓核组织中的PLA2活性均显著较第3天降低，提示均可对髓核组织中的PLA2活性起到抑制作用。且中药组髓核组织中PLA2活性略低于西药组，但差异无显著性，提示与西药相比，舒筋祛痹汤同样能起到抑制炎症因子、降低髓核组织中PLA2活性的作用。孙江涛等[6]的研究指出，PLA2被发现在突出髓核中存在后已引起广泛关注，认为正常机体内PLA2受内源性抑制物、促进物PLA2激活蛋白的相互影响，二者失衡后，机体启动PLA2蛋白，PLA2活性增高，这可能也是引起椎间盘组织发生退变的重要因素，而通过下调PLA2的活性，可恢复这种平衡，从而延缓椎间盘的退变。本研究证实了这一观点。

本实验结果显示，制模成功经大鼠灌胃后第14天，西药组、中药组血清IL-6、TNF-α浓度略高于正常组，但差异无显著性，提示经给药灌胃后，西药组、中药组血清IL-6、TNF-α浓度均得到很好控制，与正常组大鼠炎症反应程度接近；且中药组血清IL-6、TNF-α浓度略低于西药组，差异无显著性，推测舒筋祛痹汤可能发挥更好的抗炎功效，与舒筋祛痹汤可明显降低髓核组织中PLA2活性有关，但其具体机制仍需进一步探讨。

此外，本实验神经根组织形态学观察结果显示相比于正常组大鼠，中药组、西药组大鼠可见髓神经纤维脱髓鞘改变、空泡样变性等病理改变，推测髓核本身的自身免疫炎性反应是引起根性神经痛的可能因素，这一点与朴起范[7]的观点类似。值得注意的是，病理改变方面，本实验中药组出现新生的髓鞘，排列较规则，雪旺细胞大小基本一致，轴突排列整齐、无水肿；但西药组髓纤维的新生髓鞘不完整，排列欠规则，雪旺细胞数量较少，且轴突边缘不清晰，大小不均，仍可见轻度水肿变形，胞质内可见空泡，提示舒筋祛痹汤对LDH大鼠模型神经根组织形态的改善作用较为可观。

本实验证实，中药舒筋祛痹汤能明显抑制LDH大鼠移植髓核内PLA2活性，从而减轻炎症介质的合成，调节血清IL-6、TNF-α浓度，起到延缓椎间盘退变的作用[8]，这可能是舒筋祛痹汤治疗LDH的抗炎镇痛机制之一。