农杆菌侵染条件下豇豆高频再生基因型的筛选

周 雯，吴新义，汪宝根，吴晓花，鲁忠富，汪 颖，徐 沛，李国景，*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321000；2.浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州310021)

豇豆(VignaunguiculataL. Walp)，俗称角豆、豆角、带豆等，属蝶形花亚科(Fabaceae)，豇豆属(Vigna)，是豆类家族中最重要的栽培豆类作物之一。豇豆营养丰富，富含蛋白质、维生素和矿物质，在我国栽培历史悠久，栽培面积大，除高寒地区外，全国均有栽培[1]。

转基因技术现已在功能基因组学研究和农作物品种改良方面发挥了重要作用。不同作物的转基因难度差异很大，其中外植体的分化成芽率对转基因效率影响很大。常见豆科植物如大豆、豇豆、菜豆等均属于较难转化的植物，目前报道的豇豆转化率仅有1.6%左右[2-3]。即使对同一作物，其基因型[4]、外植体[5]、农杆菌菌株[6]、悬浮液浓度[7-8]、培养基[9]，以及添加的激素[10]等都会对分化率和转化率造成影响。基因型是豇豆转基因效率的重要影响因素之一。Brar等[11]研究了不同基因型对分化率的影响，结果显示在36个豇豆基因型中仅有17个表现出显著的再生率。Raji等[12]分析评估了7个非洲豇豆基因型，发现其分化率有显著差异，最终筛选出2个分化率较高的基因型。然而，上述基因型与分化率关系的研究都是在无农杆菌侵染的情况下开展的，由于不同豇豆基因型对农杆菌的敏感度有所不同，因此在无农杆菌侵染情况下筛选获得的分化率好的基因型未必在农杆菌侵染条件下表现出类似结果。

本研究从现有的豇豆种质资源出发，以农杆菌介导条件下豇豆的组织培养为基础，对51个豇豆基因型进行筛选，找到了分化率较高的优良基因型，为日后农杆菌介导下豇豆的转基因研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以浙江省农业科学院蔬菜研究所提供的51份豇豆种质为材料(表1)，进行农杆菌侵染条件下的芽分化率研究。

1.2 实验设计

1.2.1 外植体的选择

根据文献报道[2-3]，利用豇豆愈伤组织诱导其再生的频率很低，而豇豆子叶节点具有相对较高的诱导再生率，因此本研究以豇豆子叶节为诱导芽分化的外植体。

1.2.2 农杆菌菌株的选择

本研究采用携带双元表达载体pK7WG2(VIB-Plant Systems Biology)的农杆菌菌株LBA4404进行侵染。

1.2.3 基因型筛选

对51份豇豆供试材料进行两轮侵染和再生率统计试验。在第一次继代2周后观察外植体的长势并初步统计分化率，根据再生率将基因型分为3个等级，其中一级再生率在80%以上，再生率较高；二级再生率在50%～80%，再生率居中等水平；三级再生率在50%以下，再生率较低。

筛选结束后，对再生率在80%以上的每个基因型分别进行3次重复试验，每次重复使用200粒种子，并在第一次继代2周后统计分化出新芽的外植体数和每个重复的总侧芽数，进行总体的统计分析。

表1豇豆供试基因型

Table1Cowpea genotypes for analysis

基因型Genotype来源地Origin荚长Podlength/cm基因型Genotype来源地Origin荚长Podlength/cm基因型Genotype来源地Origin荚长Podlength/cmG360吉林Jilin80.0长江2号江西Jiangxi59F龙F Long江西Jiangxi63.0Changjiang No.2G98广西Guangxi85.0H18江西Jiangxi6150-27江西Jiangxi67.0之豇60 Zhijiang 60浙江Zhejiang63.0A43江西Jiangxi5944-68江西Jiangxi60.0锈5 Xiu 5浙江Zhejiang58.0R166-108①浙江Zhejiang58Q白Q Bai江西Jiangxi68.0ZH3.2.3浙江Zhejiang62.0108-R153浙江Zhejiang57麻军Majun江西Jiangxi61.0之豇616 Zhijiang 616浙江Zhejiang65.0JX3江西Jiangxi6343-57江西Jiangxi61.0长C△C1.2.1浙江Zhejiang69.0JX5江西Jiangxi61II7E0909山东Shandong62.5Chang C△C1.2.1特早30 Tezao 30浙江Zhejiang60.0JX4浙江Zhejiang59II7E0811辽宁Liaoning19.51162海南Hainan37.6白八月豇浙江Zhejiang22.5II7E0900山东Shandong46.0White August CowpeaII7E0853山东Shandong49.7JX6江西Jiangxi66II7E0826江西Jiangxi51.5II7E0827江西Jiangxi48.8JX7江西Jiangxi59II7E0831江西Jiangxi55.8II7E0815辽宁Liaoning18.3JXHZ江西Jiangxi68II7E0796江苏Jiangsu52.3II7E0813辽宁Liaoning13.2102黑 102 Hei浙江Zhejiang67II7E0838江西Jiangxi49.2II7E0812辽宁Liaoning12.7H60江西Jiangxi63II7E0778江苏Jiangsu49.7G314山东Shandong41.541-36江西Jiangxi65II7E0829江西Jiangxi37.8赣蝶二号江西Jiangxi58.0DMD江西Jiangxi58II7E0801江苏Jiangsu21.7Gandie No.2汕美2号广东Guangdong62.0M-zaas江西Jiangxi61II7E0817辽宁Liaoning24.6Shanmei No.2

1.2.4 统计分析

采用ANOVA-Duncan检验(IBM SPSS Statistics 17.0软件)对不同基因型材料的再生率进行差异显著性分析。

1.3 实验方法

1.3.1 种子消毒处理

取一定量种子放入小烧杯中，在超净工作台中用70%的乙醇消毒60 s，用无菌水冲洗3次。再加0.1%的升汞浸泡10 min，用无菌水冲洗3～4遍，倒入已灭菌的培养皿中，加无菌水浸泡过夜(28 ℃)。

1.3.2 摇菌

采用YEB培养基+50 mg·L-1利福平+50 mg·L-1壮观霉素+100 mL·L-1农杆菌，于28 ℃、200 r·min-1摇床上过夜培养至D600为0.8～1.2。

1.3.3 外植体的获取

在超净工作台中，去掉种子的表皮，将种子一分为二，留下有胚轴和胚芽的那一半种子，并在近子叶节处切除2/3的下胚轴后将种子放入液体悬浮培养基(SCM)中备用。SCM培养基配方：0.443 g·L-1MS粉+30 g·L-1蔗糖+0.1 g·L-1肌醇+3.9 g·L-1MES+0.25 mg·L-1GA3+40 mg·L-1乙酰丁香酮+1.7 mg·L-16-BA+250 mg·L-1硫代硫酸钠，调节pH至5.4。

1.3.4 侵染

将摇好的农杆菌在离心机上4 000g、10 min离心后倒掉上清液，加入液体悬浮培养基，与菌液混匀后调D600至0.4～0.6。转入无菌培养瓶中，并放入外植体于180 r·min-1摇床上振荡侵染1 h。

1.3.5 共培养

将培养瓶中的侵染液倒掉，加入液体悬浮培养基清洗3～4次，再用无菌滤纸吸干种子表面水分，置于共培养固体培养基(CCM)上(提前在固体培养基上放一张无菌滤纸)，有胚芽的一面朝上，然后用封口膜封好，放入培养室共培养3 d(28 ℃，16 h光/8 h暗)。CCM培养基配方为0.443 g·L-1MS粉+30 g·L-1蔗糖+0.1 g·L-1肌醇+3.9 g·L-1MES+0.25 mg·L-1GA3+40 mg·L-1乙酰丁香酮+1.7 mg·L-16-BA+250 mg·L-1硫代硫酸钠+8 g·L-1琼脂，调节pH至5.4。

1.3.6 筛选培养

3 d后将外植体转移至含抗生素(150 mg·L-1卡那霉素)的筛选培养基(SM)上，有胚芽的一面朝下，再用封口膜封好继续培养。SM培养基配方：0.443 g·L-1MS粉+30 g·L-1蔗糖+0.1 g·L-1肌醇+0.59 g·L-1MES+1.7 mg·L-16-BA+150 mg·L-1Kanamycin+150 mg·L-1Timentin+8 g·L-1琼脂，调节pH至5.6。

1.3.7 第一次继代培养

筛选培养2周后，将子叶、伸长的胚芽和胚轴全部切除，只留下子叶节部分转移至新的筛选培养基上进行芽分化诱导。

1.3.8 统计观察

2周后，观察豇豆外植体的分化率和长势，并进行再生率的统计。

2 结果与分析

2.1 基因型分化效率初筛选结果分析

通过对51个豇豆基因型进行农杆菌侵染条件下芽分化试验，在第一次继代培养2周后，观察不同基因型材料的长势以及再生率(图1)。将统计的再生率进行等级划分，如表2所示，编号1～24的材料再生率低于50%，为三级水平；编号25～41的材料再生率在50%～80%，为二级水平；编号42～51的材料再生率高于80%，为一级水平。

2.2 基因型复筛结果分析

经过首轮筛选后发现有10个基因型的再生率在80%以上，包括赣蝶二号、108-R153、50-27、H60、F龙、44-68、特早30、白八月豇、JX6和II7E0815。对这10个基因型分别进行3次重复试验，经过筛选培养和第一次继代培养后统计分化出新芽的外植体数和每个重复的总侧芽数，并对繁殖系数和不定芽诱导率进行差异显著性分析。如表3所示，从繁殖系数来看，在这10个品种中仅有2个品种的繁殖系数较高，包括II7E0815和白八月豇，与其他基因型相比表现出显著差异，尤以白八月豇的繁殖系数最高，为1.93，其余8个基因型的繁殖系数均在1.10～1.45；从不定芽诱导率来看，白八月豇的不定芽诱导率最高(86.40%)，其次为赣蝶二号(72.80%)、特早30(70.75%)、44-68(70.33%)、F龙(69.86%)和JX6(66.03%)，这6个基因型相互之间差异不显著。不定芽诱导率较低的基因型有50-27、H60和108-R153，分别为36.20%、44.18%和22.51%。

表2五十一个豇豆基因型再生率的初筛结果

Table2Regeneration rate in the preliminary screening of 51 cowpea genotypes

编号No.基因型Genotype供试种子数Seed number筛选培养后存活下来的外植体数Number of explants survivingafter screening and culture第一次继代培养后存活的外植体数(总侧芽数)Number of viable explants after subculture(total number of lateral buds)再生率Regenerationrate/%1Q白 Q Bai1802524(1)4.172II7E0831200177160(12)7.503II7E0817200184159(12)7.554长C△C1.2.1 Chang C△C1.2.1150130101(12)11.885II7E0813200186169(21)12.436II7E0812200180178(26)14.617II7E083820017498(15)15.308II7E0827200160157(25)16.019ZH3.2.315012072(16)22.2010锈5 Xiu 5150132120(29)24.1711II7E0826200195182(44)24.1712II7E0811220204161(44)27.3313102黑 102 Hei20011896(32)33.3314II7E0900200169155(52)33.5515JX4200174117(41)35.0416G314150124108(38)35.191741-3612610596(35)36.461811621509483(33)37.3519II7E082920017295(36)37.8920H1820016695(37)38.9521JXHZ200141135(54)40.0022II7E0853200167128(55)42.9723DMD200159128(61)47.6624R166-108①2009971(34)47.8925II7E0801200181102(53)51.9626II7E0796200165163(90)55.2127G9820010074(44)59.4628II7E0778200172169(102)60.3629JX7200159135(86)63.703043-57200148125(80)64.0031M-zaas200132118(78)66.1032II7E0909200157149(99)66.4433G360150133127(87)68.5034JX5200179148(104)70.2735之豇616 Zhijiang 616150129107(77)71.9636长江2号 Changjiang No.2200138108(81)75.0037麻军Majun180136102(78)76.4738A43200171136(105)77.2039之豇60 Zhijiang 60150123111(88)79.2840JX3200132127(101)79.5341汕美2号 Shanmei No.2200177100(80)80.0042H60200150142(114)80.2843108-R153200193140(115)82.144450-27200155153(136)88.8945JX6200161152(136)89.4746F龙F Long200172160(150)93.7547赣蝶二号Gandie No.2200170127(120)94.494844-68200176155(153)98.7149II7E0815200162153(154)100.6550特早30 Tezao 30150127117(123)105.1351白八月豇 White August Cowpea200179152(173)113.82

A，豇豆种子去除种皮后，将子叶一分为二，保留有完整胚芽和胚轴的那一半并切去胚根，准备侵染；B，与农杆菌共培养3 d后的结果；C，在筛选培养基上生长两周后的结果；D，切除子叶、胚芽、胚轴，子叶节进行芽分化诱导；E，较优基因型的子叶节在培养基上两周后形成簇芽的结果；F，分化率较差的基因型在第一次继代后不能分化出芽。A， After removal from seed coat， the cotyledon was divided into two， the half of the complete germ and hypocotyl was retained and the radical was cut off， then the infection was prepared; B， Co-culture with Agrobacterium tumefaciens after 3 d; C， The growth on the screening medium after two weeks; D， After the removal of cotyledons， plumule and hypocotyl， the bud differentiation was induced by cotyledonary; E， The cotyledonary node of the better genotype formed the cluster buds after two weeks in the medium; F， Genotypes with poor differentiation rate could not differentiate buds after first subculture.图1 豇豆基因型分化率筛选各个阶段图示Fig.1 Screening in different stages

3 讨论

传统育种方法具有一定局限性，如育种年限长、筛选工作量巨大等，而转基因手段为新品种培育提供了另一途径。目前，国内外在豆类作物转基因研究领域尚未取得重大突破，尤其是针对豇豆的研究报道更少。影响豇豆转化效率的因素多种多样，基因型是豇豆外植体芽分化和基因转化的主要制约因素之一，只有筛选出对农杆菌易感且再生能力强的豇豆基因型，才能更高效地开展豇豆转基因研究。

本研究以现有的豇豆种质资源为基础，对不同豇豆基因型的再生率进行研究，通过首轮筛选后对再生率在80%以上的10个基因型进行重复试验，依次统计出芽外植体数和总侧芽数并对繁殖系数和不定芽诱导率进行差异显著性分析。从繁殖系数的结果来看，仅有II7E0815和白八月豇2个品种的繁殖系数较高，其中尤以白八月豇的繁殖系数最高，为1.93，与其他基因型差异显著；从不定芽诱导率的结果来看，白八月豇的不定芽诱导率最高，其次为赣蝶二号、特早30、44-68、F龙和JX6，白八月豇与这5个基因型之间差异均不显著，而50-27、H60和108-R153的不定芽诱导率较低。因此，在农杆菌侵染条件下，地方栽培品种白八月豇具有相对较高的再生率。本研究结果进一步说明豇豆不同基因型在侧芽分化上存在很大差异，在开展转基因试验之前筛选合适的受体基因型是十分重要的。

除了基因型外，外植体的选择对芽的再生也有重要影响。不同外植体在转化效率和再生效率上有很大差别，Gracia等[13-14]利用豇豆的叶盘作为外植体进行转化，但是最终愈伤不能分化出植株；之后Ilori等[15]用花粉作为外植体成功获得转基因豇豆，但是转化率非常低，只有0.36%；Solleti等[2]利用子叶节外植体获得了1.64%的转化率，比前人的研究报道要高出2倍[16]；Raveendar等[3]也利用子叶节外植体取得了1.61%的转化率。有研究证明，在有子叶存在的条件下，子叶节的分化可以得到很大程度的提升[16-17]，且含有一片子叶的子叶节外植体具有较高的芽分化率[18]。通过前人的研究，我们发现豇豆子叶节外植体在芽分化上具有相对较好的优势，因此在本研究中，我们最初选择带有一片子叶的豇豆种子作为待侵染外植体，在继代培养开始时去除子叶、胚芽和胚轴，仅留下独立的子叶节诱导其芽分化。本研究的结果表明，以子叶节为外植体时，不同豇豆基因型在分化率上存在很大差异，豇豆地方品种白八月豇具有较高的不定芽诱导率和繁殖系数，此基因型可以作为后续转基因研究的候选受体材料，以期通过农杆菌介导法得到转基因豇豆植株，并为后续的基因功能验证和分子育种工作奠定基础。

表3十个豇豆基因型芽再生率的复筛结果

Table3Shoot regeneration rate in the second screening

品种Variety重复试验Replicates侵染种子数Number ofinfectedseeds第一轮继代外植体数(长出新芽外植体数)Number of firstsuccessive explants(number of explantsgrowing)两周后侧芽分化总数Total number oflateral buddifferentiationafter two weeks不定芽诱导率Adventitiousbud inductionrate/%繁殖系数Reproductioncoefficient不定芽诱导率均值Average value ofAdventitious budinduction rate/%繁殖系数均值Average valueof reproductioncoefficient108-R153重复一Replicate 1200162(39)4724.071.2022.51±2.68 a1.17±0.02 a重复二Replicate 2200133(23)2617.291.13重复三Replicate 3200172(45)5326.161.18H60重复一Replicate 1200150(80)9353.331.1644.18±5.23 abc1.17±0.02 ab重复二Replicate 2200165(66)7544.001.14重复三Replicate 3200142(50)6135.211.2250-27重复一Replicate 1200197(20)2910.151.4536.20±15.19 ab1.29±0.08 abc重复二Replicate 2200196(123)15062.761.22重复三Replicate 3200185(66)7935.681.20JX6重复一Replicate 1200148(92)11662.161.2666.03±13.88 cde1.28±0.03 abc重复二Replicate 2200158(145)19691.771.35重复三Replicate 3200154(68)8444.161.24特早30重复一Replicate 1200187(140)17874.871.2770.75±2.17 de1.22±0.03 abcTezao 30重复二Replicate 2200189(132)15469.841.17重复三Replicate 3200191(129)15867.541.22F龙重复一Replicate 1200147(111)13975.511.2569.86±4.17de1.29±0.07 abcF Long重复二Replicate 2200162(100)14861.731.48重复三Replicate 3200170(123)16372.351.33赣蝶二号重复一Replicate 1200153(121)13979.081.1572.80±3.22 de1.43±0.17 bcGandie No.2重复二Replicate 2200157(112)19671.341.75重复三Replicate 3200148(101)14068.241.3944-68重复一Replicate 1200152(123)18080.921.4570.33±5.85 de1.44±0.06 c重复二Replicate 2200176(122)16469.321.34重复三Replicate 3200163(99)15260.741.54II7E0815重复一Replicate 1200176(110)21062.501.9159.04±3.42 bcd1.70±0.10 d重复二Replicate 2200159(83)13252.201.59重复三Replicate 3200173(108)17262.431.60白八月豇重复一Replicate 1200190(178)33993.681.9086.40±4.84 e1.93±0.04 dWhite August重复二Replicate 2200188(166)31188.301.87Cowpea重复三Replicate 3200180(139)28677.222.01

表中同列数据后没有相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。

Values within a column followed by different lowercase letters indicated significant difference (P<0.05).