施钾调控烟草根系酚酸的释放及其防控青枯病的研究

陈娜　高翔　涂攀峰

摘 要 針对贵州烟草产区青枯病发病普遍和防治此病害研究不够深入的现状，本文通过田间试验研究了施用不同量的钾肥对烟草青枯病的防控效果，同时测定根系分泌物中的酚酸种类和含量，及其对烟草青枯病病原菌（Ralstonia solanacearum）的抑制作用，为农业措施上防控病害提供科学依据。结果表明，当田间施用150 kg/hm2的钾肥时，烟草青枯病发病率和病情指数最低，根际土壤中青枯病原菌的数量最少，为5.6 log cfu/g，而无钾肥处理的发病程度最高。同时，测定烟草根系分泌物中的酚酸发现，150 kg/hm2处理的肉桂酸、水杨酸和苯丙酸释放量最高。外源添加酚酸对青枯病病原菌的生长结果表明，低浓度促进了菌丝的生长，当浓度达到600 mg/L时表现为抑制的作用。此外，在田间中施钾肥显著提高了烟草的生物量、钾浓度和总酚含量。本研究结果表明，施用150 kg/hm2的钾肥时，能在生产上有效的防控烟草青枯病，其根系分泌物中的酚酸能显著抑制致病菌的生长。

关键词 烟草青枯病 ；钾肥 ；发病率 ；酚酸 ；劳尔氏菌

中图分类号 S572

Analysis on the Release of Phenolic Acids from Tobacco and Control of Tobacco Bacterial Wilt by Potassium Fertilizer

CHEN Na1，2） GAO Xiang3） TU Panfeng4） DENG Lansheng4）

（1 Guizhou Radio & TV University， Guiyang， Guizhou 550025；

2 Guizhou Vocational Technology Institute， Guiyang， Guizhou 550025；

3 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081；

4 College of Natural Resources and Environmental， South China Agricultural University，

Guangzhou， Guangdong 510642）

Abstract According to the situation of prevalence of tobacco bacterial wilt and its disease had not enough studied， the effect of different amount of potassium （K） fertilizer on tobacco bacterial wilt was studied by field experiment， the inhibitory effect of the potassium （K） fertilizer on Ralstonia solanacearum was determined， the content and varieties of phenolic acids were measured in order to provide reference for the control of tobacco bacterial wilt. The results showed that when the application amount of K fertilizer was 150 kg/hm2， the incidence and index of tobacco bacterial wilt were the lowest， the number of Ralstonia solanacearum in the rhizosphere soil was the least， which was 5.6 log cfu/g. The incidence of tobacco bacterial wilt was the highest without potassium （K） fertilizer. The amount of release of cinnamic acid， salicylic acid and phenylpropionic acid from 150 kg/hm2 were the highest. The growth effect of Exogenous phenolic acids on the Ralstonia solanacearum showed that low concentration promoted the growth， the inhibitory effect was achieved when the concentration reached 600 mg/L. In addition， K application significantly increased the tobacco biomass， K concentration and total phenol content in the field. The results showed that the application of 150 kg/hm2 of K fertilizer could effectively control tobacco bacterial wilt， the phenolic acids from root exudates could significantly inhibit the growth of Ralstonia solanacearum.

Key words Tobacco bacterial wilt ； potassium fertilizer ； disease incidence ； phenolic acids ； Ralstonia solanacearum

烟草（Nicotiana tabacum L）是茄科烟草属经济作物，其主要种植在长江流域和西南地区[1-2]。处于中国西部地区的贵州省由于优越的土地资源和水利条件，适宜烟草种植[2-3]，但长期连续种植烟草，以及气温高和空气湿度大等环境因素，导致烟草病害发生严重，特别是难以防治的土传病害，容易造成烟草的产量和品质的下降[3-4]。烟草青枯病是一种危害严重的土传维管束病害，由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起，发病后烟草叶片支脉间出现黑色的斑纹，根系变黑腐烂，最终整棵植株叶片枯萎[4]。防治该病害主要是使用化学农药，虽然能控制病害的发生和传播，但是过量的使用农药不但造成烟叶品质的下降，还容易造成环境的污染问题[4-5]。因此，利用科学的施肥策略来防控病害的发生，对提高烟草的产量和品质，以及维持烟草产业的持续性发展，具有重要的理论和实践意义。

钾是植物生长发育所必需的营养元素之一，参与植物生理过程中的各种生化反应，还能增强植物在病虫害、干旱、盐害等胁迫下的抗逆能力[6-7]，也能调控植物产生次生代谢产物（例如酚类）抵抗病原菌的侵染[7-8]。据研究发现，施钾肥能有效抑制柠檬流膠病、玉米茎腐病、山茱萸炭疽病和油菜黑斑病的发生[6-9]。目前研究钾对植物的抗性机理主要在地上部分，但地下部根系是植物吸收营养和水分的主要器官[9-10]。而根系分泌物能为土壤微生物提供大量的营养物质，且分泌物中的酚酸物质与连作障碍有密切的关系[10-11]。因此，本研究在前人研究基础上，通过设置田间试验，研究不同施钾肥水平对烟草青枯病的防控效果，并鉴定烟草根系分泌物中酚酸的种类和含量，并测定这些酚酸对抑制烟草青枯病病原菌生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2017年在贵州省毕节地区烟草种植试验地进行，土壤的基本理化形状：pH 5.5，有机质12.3 g/kg，速效氮114.8 mg/kg，速效磷13.9 mg/kg，速效钾98.2 mg/kg。烟草移栽时间为2017年4月13日，烟草青枯病调查时间为7月8日。选用烟草品种为青枯病敏感品种DJY。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

田间试验设置5个处理，分别为：K0无钾肥；K75施用75 kg/hm2钾肥；K150施用150 kg/hm2钾肥；K225施用225 kg/hm2钾肥；K300施用300 kg/hm2钾肥，钾肥为K2O。氮和磷的施用量为：氮肥100 kg/hm2，磷肥P2O5 75 kg/hm2。每个处理小区面积为64 m2，设置3个重复，采用随机区组设计。田间管理参照当地烟草栽培生产技术。

1.2.2 测定项目及方法

在调查烟草青枯病时，采取以下病害的分级方法：0级，烟草无病斑；1级，烟草茎部偶有褪色病斑，或有条斑一侧有少数叶片凋萎；2级，茎部有黑色条斑，但尚未达到烟草顶部，或发病一侧有半数以上叶片萎蔫；3级，烟草茎部的黑色条斑达到植株顶部，或病侧有三分之二以上叶片凋萎；4级，植株基本枯死[12]。病情指数的计算方法：[（∑各级数×该级株数）/（最高等级数×调查总株数）]×100[13]。每个处理取5个点进行调查，每个点选取10株，一共调查50株烟草，逐一记载烟草病害分级。调查完烟草青枯病后，采集烟草植株进行各指标的检测，主要包括：整株生物量，钾和总酚含量，每个指标为3次生物学重复。同时将烟草青枯病发病植株带回实验室进行病害鉴定，以确定病原菌为Ralstonia solanacearum。同时采集烟草根际土样品，每个处理随机选取5株进行根际土收集，样品保存于4 ℃冰箱用于测定土壤中青枯病病原菌的数量，在SMSA培养基上进行统计病原菌[12]。

测定指标的主要方法：收获的烟草样品先在105 ℃下杀青30 min，然后于75 ℃下烘干至衡重后称重为生物量；将样品粉碎，利用H2SO4-H2O2进行消煮，用火焰光度计法测定植株的钾浓度；总酚含量的测定：取1 g样品，加入5 mL含有1 % HCl的甲醇溶液，提取24 h，取0.l mL提取液稀释，定容至5 mL摇匀，用分光光度计的280 nm处OD值为总酚含量。SMSA培养基用于根际土壤中烟草青枯病原菌数量的测定[12]。

烟草根系分泌物的收集及鉴定，在烟草种植30 d后从田间取出，用灭菌水清洗烟草根系，然后放入1 000 mL的塑料杯中放入光照培养室培养24 h（16 h光/8 h黑暗），将塑料杯中的液体在冷冻干燥机中冻干待用，用于测定分泌物中的酚酸，每个处理3次重复。依据Ling等[14]研究方法，采用高效液相色谱 （HPLC，Agilent 1200，USA）进行酚酸测定，通过外标法计算出各酚酸在根系分泌物中的组成和含量。依据HPLC的结果，分别配置根系分泌物中的3种酚酸溶液，分别配制0、100、200、400、600 mg/L酚酸含量的培养基，测定3种酚酸溶液对病原菌生长的影响[12]。

1.3 数据统计

用Excel 2016对原始数据进行处理，利用SAS9.0对数据进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 田间不同钾肥施用量对烟草青枯病发病的影响

施钾肥能显著降低烟草青枯病害的发生（表1）。当施钾量为K150（150 kg/hm2）时，发病率和病情指数最低，K225（225 kg/hm2）处理次之，无钾肥处理K0（0 kg/hm2）的最高。K150处理比K75（75 kg/hm2）和K0（0 kg/hm2）处理的发病率分别降低了24 %和34 %，病情指数分别降低32 %和20 %，但是施钾量为K300（300 kg/hm2）时，其发病程度反而比K150处理增加。在烟草土壤根际土中的青枯病原菌含量上，K150处理的病原菌含量是最少的，比K0和K75分别降低了32 %和11 %，K0处理中青枯病原菌含量最高。说明施钾能显著的降低烟草青枯病害的发生，同时减少了病原菌在根际土壤中的含量，但并不是钾肥施用越多，其发病程度就越低。

2.2 田间不同钾肥施用量对烟草生物性状的影响

施钾显著提高了烟草的生物量、钾浓度和总酚的含量（表2）。烟草的生物量表现为K225最高，K300次之，K0最差。K225处理的烟草生物量比K0和K75处理分别显著提高了94 %和57 %，但是K150与K225和K300处理之间生物量没有显著性差异，说明钾肥需要适量的施用，并不是钾肥施用量越大，其生物量就越高。在植株的钾浓度和总酚含量的指标上，当钾肥施用的量越多，植株的钾浓度越高。K300处理的钾浓度比K0和K75分别提高了60 %和23 %。在总酚含量上可看出，K150处理的总酚含量最高，但是与K225和K300处理之间差异不显著，但这3个处理的总酚含量均显著高于K0和K75处理。

2.3 田间不同钾肥施用量对烟草根系分泌物中酚酸含量的影响

钾水平显著改变了烟草根系分泌物中酚酸的含量（表3）。在肉桂酸含量上，K150处理的含量是最高的，K225处理次之，K0含量最少。例如，K150处理的肉桂酸含量比K0和K75处理分别显著提高了3.75倍和1.53倍。虽然K300处理的施钾肥量是最高的，但与K150处理相比，还显著的降低了肉桂酸的分泌量。在水杨酸含量上，K150处理的含量是最高的，但是K225和K300处理的含量与K150差异不显著，但均显著高于K0和K75处理的水杨酸含量，K150处理比K0和K75处理显著提高了171 %和72 %。在苯丙酸含量上，K150处理的也是最高的，K225处理次之，K0含量最少。K150比K0和K75处理分别显著提高了2.96倍和1.73倍。说明在田间施用不同量的钾肥，能显著调控烟草根系分泌物中的酚酸含量，而在K150处理中，肉桂酸、水杨酸和苯丙酸的含量均是最高的，K0处理最低。

2.4 添加不同浓度的酚酸对烟草青枯病病原菌菌丝干重的影响

由表4可知，添加不同浓度的酚酸对烟草青枯病病原菌菌丝干重有显著的影响，均表现为低浓度的酚酸能促进病原菌的生长，当浓度高于400 mg/L时，表现为抑制的作用，当浓度达到600 mg/L时，有显著的抑制效果。在肉桂酸上，当浓度为200 mg/L时，烟草青枯病病原菌菌丝干重比0 mg/L处理显著提高了10 %，但比浓度为600 mg/L时抑制效果显著降低了20 %。水杨酸和苯丙酸也有相同的趨势，当浓度为600 mg/L时抑制效果最明显。

3 讨论与结论

本研究证明了在田间施用适量的钾肥（150 kg/hm2），能显著的降低烟草青枯病的发病率和病情指数，同时病原菌在根际土壤中的含量最少（表1）。相对于其它的施钾肥处理，K150处理的烟草青枯病发病程度最低，其主要是由于施钾增加了烟草的生物量，提高植株的钾浓度，以及与抗病相关的总酚含量（表2）。同时，施钾调控了烟草根系分泌物中的酚酸物质的含量，K150处理显著增加了肉桂酸、水杨酸和苯丙酸的含量，其测定酚酸对烟草青枯病病原菌的影响时，表现为低浓度促进菌丝生长，而高浓度则抑制。而当施钾量超过150 kg/hm2时，并没有显著降低烟草青枯病的发生，反而有增加的趋势，根系分泌物中的酚酸含量也有所降低，这证明了在田间施用钾肥，应该按照作物所需供肥，才能实现植株生物量和抵抗病害的最大化利益。

钾元素具有提高植物抗逆境胁迫的功能，当植物受到病原物侵染时，可通过调节酚类代谢来抵御病原菌的侵害，从而提高植物的抗病性[6-9，11，15]。本研究结果发现，施钾肥能显著提高烟草对青枯病害的抵抗，施钾肥后烟草通过提高植株中的总酚含量（表2），降低了烟草青枯病的发病严重程度（表1）。这与前人的研究报道相似，喷施钾肥提高了小麦叶片中酚类物质的含量，从而增强了小麦对白粉病的抵抗能力[16]；施钾提高了棉花中的棉酚含量，而棉酚含量的提高则降低了黄萎病害的发生[17]。同时，本研究结果发现，田间施钾可显著增加了烟草的钾浓度（表2），而钾浓度的提高，可增加植物细胞壁的厚度，能在物理屏障上抵御病原菌的入侵[9，11]。在烟草根际中，K150处理的病原菌含量最少，这主要由于施钾调控了烟草根系分泌物中的酚酸物质（表3），酚类物质的种类和浓度对根际土壤微生物的分布具有一定的影响，能促进或抑制土传病原菌的繁殖，可改变植物的根际微环境[13-15]。根系分泌物中的酚酸是重要的化感物质，已有多种酚酸被证明能显著的抑制病原菌的生长和繁殖[13-15]。这些酚酸物质可以通过HPLC、GC/MS等仪器进行分离鉴定，本研究通过HPLC鉴定出3种酚酸类物质，分别为肉桂酸、水杨酸和苯丙酸（表3），并通过研究其对烟草青枯病病原菌生长的影响，发现3种酚酸均呈现低浓度促进病原菌的生长，高浓度抑制的效果（表4）。这结果与谭秀梅等[18]的研究结果是相似的，其通过外源添加酚酸对土壤细菌、真菌和放线菌的影响，表现为低浓度促进，而高浓度抑制微生物的生长。同时，Gao等[13]研究发现，当外源添加浓度为40 mg/L的肉桂酸时，能显著抑制大豆红冠根腐病病原菌的生长和产孢。Hao等[19]发现水杨酸显著促进西瓜枯萎病病原菌孢子的萌发，但浓度达到80 mg/L时却抑制了孢子的萌发，其抑制率可达65 %。此外，水杨酸被认为是植物抗性通路中的重要物质，能提高植物对病原菌的抗性[19-20]。因此，推断烟草根系分泌物中的酚酸物质是抑制烟草青枯病发生的化感物质之一。同时，施钾提高作物对病害的抗性机制，并不是改变根系分泌物这一条途经那么简单，钾对防治烟草病害的抗性机理有待深入探讨。

本研究结果表明，在田间当钾肥施用量为150 kg/hm2时，能有效的降低烟草青枯病的发病程度，提高了植株的生物量、钾浓度和总酚含量；也增加了根系分泌物中的肉桂酸、水杨酸和苯丙酸浓度，这些酚酸在浓度为600 mg/L时能显著抑制烟草青枯病病原菌的生长。本研究对施钾在农业生产上防治烟草青枯病的发生提供了简单可行的策略和理论依据。

参考文献

[1] 李 想，刘艳霞，陆 宁，等. 综合生物防治烟草青枯病及其对土壤微生物群落结构的影响[J]. 土壤学报，2017，54（1）：216-226.

[2] 王 刚. 我国烟草病蟲害防治研究策略探讨[J]. 中国烟草科学，2003，24（4）：37-39.

[3] 陈 娜. 施钾肥对烟草白粉病发生的防控效果[J]. 安徽农业科学，2017，45（3）：171-173.

[4] 蒋岁寒，刘艳霞，孟 琳，等. 生物有机肥对烟草青枯病的田间防效及根际土壤微生物的影响[J]. 南京农业大学学报，2016，39（5）：784-790.

[5] 郑继法，丁爱云，王智发. 烟草细菌性病害识别及其综合防治技术[J]. 烟草研究与管理， 2000，35（5）：26-27.

[6] Wang M， Zheng Q， Shen Q， et al. The critical role of Potassium in plant stress response[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2013， 14 （4）： 7 370-7 390.

[7] Christian Z， Mehmet S， Edgar P. Potassium in agriculture-status and perspectives[J]. Journal of Plant Physiology. 2014， 171（9）： 656-669.

[8] 李文娟，何 萍，金继运. 氯化钾对玉米茎腐病抗性反应中酚类物质代谢的影响[J]. 植物营养与肥料学报，2008，14（3）：508-514.

[9] Dordas C. Role of nutrients in controlling plant disease in sustainable agriculture： A review[J]. Agronomy for Sustainable Development， 2008， 28 （1）： 33-46.

[10] Wu K， Yuan SF， Wang LL， et al. Effects of bioorganic fertilizer plus soil amendment on the control of tobacco bacterial wilt and composition of soil bacterial communities[J]. Biology and Fertility of Soils， 2014， 50 （6）： 961-971.

[11] 刘晓燕，何 萍， 金继运. 钾在植物抗病性中的作用及机理的研究进展[J]. 植物营养与肥料学报，2006，12（3）：445-450.

[12] Liu X， Shi J， Feng Y， et al. Tobacco bacterial wilt can be biologically controlled by the application of antagonistic strains in combination wilt organic fertilizer[J]. Biology and Fertility of Soils， 2013， 49： 447-464.

[13] Gao X， Wu M， Xu R， et al. Root interactions in a maize/soybean intercropping system control soybean soil-borne disease， red crown rot[J]. Plos One， 2014； 9： e95031.

[14] Ling N， Huang Q， Guo S， et al. Paenibacillus polymyxa SQR-21 systemically affects root exudates of watermelon to decrease the conidial germination of Fusarium oxysporum f.sp. niveum[J]. Plant and Soil， 2011， 341： 485-493.

[15] Zorb C， Senbayram M， Peiter E. Potassium in agriculture-status and perspectives[J]. Journal of Plant Physiology， 2014， 171： 656-669.

[16] Nicholson R L， Hammerschmidt R. Phenolic compounds and their role in disease resistance[J]. Annual Review of Phytopathology， 1992， 30： 369-389.

[17] 夏正俊，顾本康，吴蔼民，等. 棉花品种抗黄枯萎病性与体内生化成分相关分析[J]. 植物保护学报，1994，21（4）：305-310.

[18] 谭秀梅，孔令刚，王华田. 杨树人工林连作土壤中酚酸类化感物质的累积规律及其对微生物群落的影响[J]. 山东大学学报，2008，41（1）：14-19.

[19] Hao W Y， Ren L X， Ran W， et al. Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants on Fusarium oxysporum f.sp. niveum[J]. Plant and Soil， 2010， 336： 485-497.

[20] Wu H S， Raza W， Fan J Q， et al. Antibiotic effect of exogenously applied salicylic acid on in vitro soilborne pathogen， Fusarium oxysporum f.sp.niveum[J]. Chemosphere， 2008， 74： 45-50.