脱氧雪腐镰刀菌烯醇暴露对仔猪海马神经细胞 神经递质、脂质过氧化及钙稳态的影响

王希春 储小燕 张娅菲 朱 雷 范梦雪 冯士彬 李 玉 吴金节

(安徽农业大学动物科技学院，合肥230036)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又称为呕吐毒素，是由多种镰刀菌侵染小麦和玉米等谷类作物产生的一种有毒次级代谢产物，由于其在食物链中具有高水平暴露和高污染频率特性而受到极大关注[1-2]。DON作为谷物中检出率和检出量最高的霉菌毒素，对人类和动物的健康构成了严重威胁[3]。通过研究DON对动物流行病学的影响，食品科学委员会(SCF)在2002年已经设定了DON的每日可接受摄入量(TDI)为1.0 μg/kg[4]。研究表明，DON对动物的毒性作用主要体现在损害免疫系统、胃肠道和大脑的健康[5]。当猪摄入DON后，表现为采食量下降，体重增加缓慢，摄入的DON至少有67%被吸收，表明猪对DON有高度敏感性[6]。Lessard等[7]给仔猪饲喂DON污染饲粮，发现回肠中主要抗氧化剂谷胱甘肽过氧化物酶2(GPx-2)基因表达上调，而编码酶的抗氧化剂谷胱甘肽过氧化物酶3(GPx-3)、超氧化物歧化酶3(SOD-3)基因表达下调，表明DON对仔猪肠道免疫系统具有一定的毒性作用。尽管有人认为成年家畜对DON具有一定的耐受性，但DON对仔猪的毒害作用尤其是对神经系统的损伤却不容忽视。Gaigé等[8]试验证明，脑是DON的敏感区域，也是激活神经元的区域，下丘脑和脑干能调节DON引起的反应。耿芳芳等[9]研究报道，DON可影响雏鸡脑组织中神经递质5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)的分泌，同时改变神经细胞中钙离子(Ca2+)和组织中钙调蛋白(CaM)含量及组织中CaMmRNA相对表达量，表明DON体内暴露可对雏鸡产生一定的神经毒性。

研究发现，DON对胃肠道黏膜细胞和淋巴细胞等均具有一定的损伤作用[1,10]。目前DON对动物体内和体外毒性作用的研究较多，而关于DON对神经细胞毒性作用的体外研究尚未见报道。由于猪是对DON最敏感的试验动物，而海马神经细胞是中枢神经系统中最容易受外界因素影响而受损的区域，因此，本试验以仔猪海马神经细胞(piglet hippocampal nerve cells，PHNCs)为对象，研究DON染毒后对细胞中神经递质、脂质过氧化及钙稳态的影响，以探讨DON诱导的仔猪海马神经细胞毒性作用，为进一步阐明DON的毒性机理提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

仔猪海马神经细胞购自赛齐生物有限公司；DON标准品(浓度大于99%)购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基购自美国HyClone有限公司；胎牛血清、二甲基亚砜购自美国Clark有限公司；胰酶细胞消化液购自碧云天生物技术公司；5-HT、DA、乙酰胆碱(ACH)、γ-氨基丁酸(GABA)、NE、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)试剂盒均购自上海源叶生物科技有限公司；Ca2+、CaM试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司。

CO2恒温培养箱购自美国Thermo公司；微量移液器购自美国Eppendorf公司；Multiskan Mk3型酶标仪购自上海赛默飞世尔仪器有限公司；TGL-18R台式高速离心机购自珠海黑马医学仪器有限公司；超净工作台购自苏州智净净化设备有限公司；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机购自宁波新芝科器研究所；Arktik多功能PCR仪购自美国Thermo公司。

1.2 仔猪海马神经细胞的培养和分组

将1 mg DON用无菌水配制成1 mg/mL DON基础工作液，将其加入到DMEM高糖培养基中，配制DON质量浓度分别为0、125、250、500、1 000 和2 000 ng/mL的工作液。于25 cm2正方细胞培养瓶内用DMEM高糖培养基(添加体积分数10%的胎牛血清和适量抗生素)培养仔猪海马神经细胞，培养条件为37 ℃、体积分数为5% CO2。将生长状态良好的仔猪海马神经细胞用DMEM高糖培养基调节至细胞密度为5×105个/mL，接种于6孔板内连续培养24 h，然后再用配制好的不同质量浓度的DON处理细胞24 h后，收集处理后的细胞用于神经递质、脂质过氧化及钙稳态指标的检测。

1.3 神经递质、脂质过氧化指标的检测

仔猪海马神经细胞染毒培养24 h后，收集细胞，1 000 r/min离心5 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。之后向每个样品中加入500 μL含0.1% Triton X-100的0.1 mol/L Tris-HCl(pH=7.4)，在冰水浴中进行超声裂解。将细胞裂解液以l 000 r/min离心10 min，收取上清液，按照试剂盒说明书中操作步骤进行测定，用酶标仪读取波长450 nm的吸光度(OD)值，利用测得的标准曲线计算细胞中神经递质5-HT、DA、ACH、GABA、NE含量，脂质过氧化指标CAT、GSH-Px、SOD活性和T-AOC及NO、MDA含量。

1.4 钙稳态相关指标的检测

1.4.1 细胞中Ca2+、CaM含量检测

仔猪海马神经细胞染毒培养24 h后，收集细胞，1 000 r/min离心5 min，用PBS洗涤并悬浮细胞，在冰水浴中进行超声裂解。将裂解后的细胞悬液以3 000 r/min离心3 min，收取上清液，部分保存于-20 ℃冰箱，部分进行蛋白浓度测定，之后按照Ca2+检测试剂盒(甲基麝香草酚蓝微板法)和猪CaM检测试剂盒(酶联免疫吸附测定法)说明书中操作步骤进行测定，用酶标仪读取波长450 nm的OD值，计算细胞中Ca2+和CaM含量。

1.4.2 细胞中CaMmRNA表达量检测

将接种于6孔细胞培养板的仔猪海马神经细胞经不同质量浓度的DON染毒处理24 h后，吸弃培养板中的液体，向每孔中加入1 mL Trizol裂解液，用无RNase枪头反复吹打，提取RNA；RNA使用StarScript Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Mix在42 ℃反转录30 min，85 ℃ 5 min使反转录酶失活，获得所需cDNA。

根据GenBank中发布的猪CaM(NM_001244209.1)和18S RNA(NR_046261.1)全基因序列，运用Prime 5.0软件设计特异性上、下游引物，并利用GenBank BLAST进行同源性检索，之后由通用生物系统(安徽)有限公司合成。引物序列及参数见表1。

表1 CaM目的基因和18S RNA内参基因引物参数

参照StepOneTMReal-time PCR System和BIOMIGA SYBR qPCR Mix配制PCR反应体系，然后按以下程序进行PCR扩增：95 ℃预变性2 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃延伸5 min。熔解曲线95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，每10 s以0.5 ℃的速度由55 ℃升温至98 ℃。试验组的目的基因CaM和内参基因18S RNA均在同一参数下进行3个重复试验。以无DON处理的仔猪海马神经细胞为内参(设定其表达水平为1)，采用2-△△CT法计算试验组仔猪海马神经细胞CaMmRNA相对表达量，其中△△Ct的计算公式为:

△△Ct=(Ct试验组CAM基因-Ct试验组18S RNA基因)-

(Ct对照组CAM基因-Ct对照组18S RNA基因)。

1.5 数据处理

试验数据均以平均值±标准差表示，采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，LSD进行差异显著性检验。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。运用GraphPad Prism 5.0数据软件进行柱状图的绘制。

2 结 果

2.1 DON对仔猪海马神经细胞中神经递质的影响

不同浓度DON对仔猪海马神经细胞中神经递质的影响见表2。由表可知，随DON浓度的增加，5-HT、DA、ACH、GABA含量均呈升高趋势，而NE含量呈降低趋势。与对照组相比，当DON浓度为1 000 ng/mL时，5-HT、DA、ACH含量显著升高(P<0.05)，GABA含量极显著升高(P<0.01)，而NE含量显著降低(P<0.05)；当DON浓度为2 000 ng/mL时，5-HT、DA、ACH含量极显著升高(P<0.01)。

2.2 DON对仔猪海马神经细胞中脂质过氧化指标的影响

不同浓度DON对仔猪海马神经细胞中脂质过氧化指标的影响见表3。由表可知，随DON浓度的增加，CAT、GSH-Px、SOD活性，T-AOC和NO含量呈降低趋势，而MDA含量呈升高趋势。与对照组相比，当DON浓度为250 ng/mL时，SOD活性和T-AOC极显著降低(P<0.01)；当DON浓度为1 000 ng/mL时，GSH-Px活性显著降低(P<0.05)，NO含量极显著降低(P<0.01)，而MDA含量极显著升高(P<0.01)；当DON浓度为2 000 ng/mL时，CAT活性显著降低(P<0.05)，GSH-Px活性极显著降低(P<0.01)。

2.3 DON对仔猪海马神经细胞中Ca2+和CaM含量的影响

不同浓度DON对仔猪海马神经细胞中Ca2+和CaM含量的影响见图1。由图可知，随DON浓度的增加，Ca2+和CaM含量呈升高趋势。与对照组相比，当DON浓度为125 ng/mL时，Ca2+含量有升高趋势(P>0.05)，CaM含量极显著升高(P<0.01)；当DON浓度为250 ng/mL及以上时，Ca2+含量极显著升高(P<0.01)。

表2 DON对仔猪海马神经细胞中神经递质的影响

同列数据无肩标表示与对照组相比差异不显著(P>0.05)，*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)，**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。下表同。

In the same column, values with no superscripts mean no significant difference compared with control group (P>0.05), while with * mean significant difference compared with control group (P<0.05), and with ** mean significant difference compared with control group (P<0.01). The same as below.

表3 DON对仔猪海马神经细胞脂质过氧化指标的影响

2.4 DON对仔猪海马神经细胞中CaM mRNA相对表达量的影响

不同浓度DON对仔猪海马神经细胞中CaMmRNA相对表达量的影响见图2。由图可知，与对照组相比，当DON浓度为125 ng/mL时，CaMmRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)；当DON浓度为250 ng/mL及以上时，CaMmRNA相对表达量极显著升高(P<0.01)，说明DON浓度的增加会促进细胞中CaMmRNA的表达。

3 讨 论

DON是一种B型单端孢霉烯族类毒素，主要由镰刀菌次生代谢产生，广泛污染植物源性产物，如农产品和饲料[11-12]。研究证明，DON对原核细胞和真核细胞都有显著的毒性作用[13-14]。国内外已有很多关于DON对动物脑、胃肠道、生殖系统以及免疫系统的研究，而对猪神经细胞毒性作用的研究仍不深入，本试验选用仔猪海马神经细胞作为研究对象，来探讨DON染毒后对神经细胞中神经递质、脂质过氧化及钙稳态相关指标的影响。

研究发现，DON能够通过血脑屏障到达脑部，通过刺激脑部不同区域导致脑组织异常。较低慢性剂量DON会引起猪厌食，较高急性剂量DON会引起猪呕吐[15]。DON能影响大脑神经递质的分泌，研究表明，位于脑和胃肠道中的神经递质5-HT可能参与调节DON诱导的某些效应[16]。Swamy等[17-18]研究报道，DON会引起断奶仔猪脑桥NE含量降低，下丘脑和脑桥5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)含量升高；脑部5-HT含量升高，与NE含量呈相反趋势。本试验研究结果表明，不同浓度DON对仔猪海马神经细胞攻毒24 h后，细胞中5-HT、DA、ACH、GABA含量随DON浓度的增加呈升高趋势，而NE含量呈降低趋势，这与以上报道相一致。

A：DON对仔猪海马神经细胞中Ca2+含量的影响；B：DON对仔猪海马神经细胞中CaM含量的影响。数据柱标注*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)，**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。下图同。

A: Effects of DON on the content of Ca2+in PHNCs; B: Effects of DON on the content of CaM in PHNCs. Data column with * mean significant difference compared with control group (P<0.05), and with ** mean significant difference compared with control group (P<0.01). The same as below.

图1DON对仔猪海马神经细胞中Ca2+和CaM含量的影响

Fig.1 Effects of DON on the contents of Ca2+and CaM in PHNCs

图2 DON对仔猪海马神经细胞中 CaM mRNA相对表达量的影响Fig.2 Effects of DON on the relative expression level of CaM mRNA in PHNCs

抗氧化系统在动物机体中占很重要的地位[19]。已有研究证明，对小鼠进行DON攻毒，发现DON会降低小鼠脑抗氧化系统活性，并遭受氧化应激[20]。Kanbur等[21]研究表明，联合使用玉米赤霉烯酮(ZEA)和DON，可使小鼠产生自由基，并影响机体的抗氧化功能。Ren等[22]对小鼠进行DON攻毒，发现攻毒组的脑组织MDA含量升高，脑组织SOD、GSH-Px活性降低，表明小鼠脑功能受DON的影响。耿芳芳等[23]对雏鸡进行DON攻毒，发现脑组织CAT、SOD、GSH-Px活性，T-AOC及NO含量显著降低，而MDA含量显著升高。本试验研究证明，DON暴露降低仔猪海马神经细胞CAT、GSH-Px、SOD活性，T-AOC和NO含量，升高MDA含量，这与上述研究结果相符。

钙稳态是指机体正常代谢过程中细胞内游离Ca2+浓度与细胞外Ca2+浓度之间较恒定的梯度差，是维持细胞完整性和功能的主要因素[24]。神经细胞内异常增加的Ca2+作为第二信使，通过多途径钙信号转导，引起涉及蛋白质修饰的短时程反应和改变基因表达的长时程适应性反应[25]。胞质内Ca2+最主要的结合蛋白是CaM。Ca2+-CaM复合物可以调节钙调素依赖性蛋白激酶、蛋白磷酸酶、腺苷酸环化酶、一氧化氮合酶等酶的活性，进而改变突触蛋白的活性，或通过信号转导机制激活相应的基因表达，参与多种细胞内信号反应等病理过程[26-27]。任志华等[28]研究表明，DON暴露能够增加鸡脾脏淋巴细胞中Ca2+含量和CaMmRNA表达量，且均显著或极显著高于对照组，表明DON能引起鸡淋巴细胞中钙稳态失衡，这与本试验结果是一致的，表明DON能够刺激仔猪海马神经细胞，引起钙稳态失衡。

4 结 论

综上所述，通过体外暴露试验表明，DON可促进仔猪海马神经细胞中神经递质5-HT、DA、ACH和GABA的分泌，抑制NE的分泌；升高细胞脂质过氧化指标MDA含量，降低CAT、GSH-Px、SOD活性，T-AOC和NO含量；同时增加神经细胞中Ca2+和CaM含量以及CaMmRNA基因相对表达量，并呈剂量依赖关系。上述结果表明DON暴露可对仔猪海马神经细胞产生一定的神经毒性。