不同癌种患者外周血Survivin及其剪接变异体的表达研究

卢杰，邓珊珊，姜世君，江荣科（.大庆医学高等专科学校，黑龙江大庆633；.大庆龙南医院，黑龙江大庆633）

早期发现癌症，筛查非常重要，但传统肿瘤标志物缺少所需灵敏度。据文献报道，存活素（Survivin）主要分布于大多数常见肿瘤组织内，在肿瘤的诊断中具有重要作用。Survivin蛋白有2种具有不同抗凋亡特性的新的Survivin剪接变异体，一种是缺乏外显子3的Survivin-△EX3；一种是保留了部分内含子2作为隐性外显子的Survivin-2B。通过转染实验研究2种剪接变异体对凋亡的调控发现，Survivin-△EX3保留了抗凋亡特性，而Survivin-2B的抗凋亡能力明显降低。Survivin可用荧光定量PCR（qRT-PCR）检测，qRT-PCR采用独特封闭反应，减少了污染，可靠性高，且操作时间短。本研究应用qRT-PCR检测了肺癌、乳腺癌、结直肠癌和胃癌患者外周血Survivin及其剪接变异体——Survivin-△EX3、Survivin-2B mRNA表达量及检出率，探讨了作为肿瘤标志物的外周血Survivin及其剪接变异体诊断早期癌症是否更为灵敏，旨在为进一步早期癌症的筛查提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 材料与仪器 总RNA抽提试剂购自美国Invtrogen公司，逆转录酶、DNA分子标准2000均购自宝生物工程（大连）有限公司，RNA抑制剂、6×上样缓冲液均购自美国Fermentas公司，荧光核酸凝胶染料购自美国Biotium公司，超纯水购自韩国BIONEER公司，qRTPCR 8联管购自美国BIO-RAD公司，PCR引物由北京擎科生物工程有限公司合成，2720型PCR仪购自美国ABI公司，四通道qRT-PCR仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 2013—2015年采集大庆龙南医院新入院且未进行放、化疗或手术治疗的90例肿瘤患者静脉血，以乙二胺四乙酸二钾抗凝管采集抗凝血，其中乳腺癌患者22例，肺癌患者23例，结直肠癌患者23例，胃癌患者22例。另采集30例职工体检者静脉血作为对照组。90例肿瘤患者均经病理类型组织细胞学、影像学、临床表现等确诊。

1.2.2 引物设计 应用Primer premier5.0软件设计并合成特异性引物。见表1。

表1 引物设计

1.2.3 RNA提取 采用通用型RNA快速提取试剂盒，提取样品RNA，最后加入30.00µL无RNase的水，溶解RNA。

1.2.4 DNase I消化样品RNA中DNA 10µg RNA模板、4.00µL核糖核酸酶抑制剂、10.00µL脱氧核糖核酸酶Ⅰ缓冲液、10.00µL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、焦碳酸二乙酯处理水至 100.00µL，混匀37℃90 min。取各个RNA样品4.00µL，琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。

1.2.5 RNA反转录为cDNA RNA反转录为cDNA的具体操作：3µg RNA 模板、4.00µL引物（50µmol/L）、焦碳酸二乙酯处理水至25.00µL，混匀70℃5 min，立即冰浴。8.00µL 6×上样缓冲液、4.00µL脱氧核糖核苷三磷酸 10 mmol/L、1.00 µL RNase Inhibitor，混匀 37 ℃5 min，加入2.00µL反转录酶，42℃保温60 min，于70℃温育10 min，结束反应，置冰上保存，以备PCR实验。

1.2.6 PCR检测 取0.2 mL薄壁PCR管，分别编号。向各管中加入含染料2×PCR扩增预混和溶液10.00µL，10 mol/L各基因引物混合物1.00µL，对应的cDNA各2.00µL，其中1管不加模板作为阴性对照，各管补加水至20.00µL，混匀后置于PCR仪中95℃预变性5 min，95℃15 s→65℃30 s，40个循环；120 V电压下电泳20 min，电泳结束后采用凝胶紫外分析仪照相保存。

1.2.7 qRT-PCR实验 取0.2 mL薄壁PCR管，分别编号，加入1.00µL cDNA模板、0.50µL 10 mmol/L引物、12.50µL 2×PCR扩增预混和溶液、1.25µL实时定量PCR DNA结合染料，用双蒸水补至25.00µL，混匀，置于qRT-PCR仪中。95℃预变性5 min后，95℃15 s→65℃30 s（荧光检测），40个循环。溶解曲线65～95℃。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料以表示，组间比较采用t检验、LSD-t检验等；正态分布资料采用直条图描述，非正态分布资料采用箱式图。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 总RNA提取结果 各组研究对象提取的总RNA经核酸蛋白测定仪测定为6.8～22.7µg/mL，A260/A280比值为1.8～2.1，说明提取的RNA浓度适当，纯度高。RNA提取物于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，结果每条泳道对应都有3条亮带，从上至下依次为28、18、5 S，说明RNA产物完整性较好。不同癌种RNA电泳图见图1。

图1 不同癌种RNA电泳图

2.2 PCR扩增结果 以反转录cDNA为模板扩增目的片段，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，大小与目的片段一致，条带清晰，无引物二聚体，能满足后续实验的要求。PCR扩增产物电泳图见图2。

图2 PCR扩增产物电泳图

2.3 qRT-PCR结果

2.3.1 扩增曲线及溶解曲线 扩增曲线基线平直，各管平行性良好，扩增效率相近。溶解曲线峰值较高，尖峰，且无杂峰，表明扩增产物特异性高，扩增体系良好。见图3。

2.3.2 各组研究对象 Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3相对表达量比较 与对照组比较，肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌Survivin mRNA、Survivin-△Ex3 mRNA相对表达量均明显升高，Survivin-2B mRNA相对表达量均明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图 4～6。

图3 扩增曲线和溶解曲线

表2 各组研究对象Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3相对表达量比较（±s）

表2 各组研究对象Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3相对表达量比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05

检测项目Survivin Survivin-2B Survivin-△Ex3胃癌（n=22）1.850±0.402a 0.061±0.052a 0.911±0.110a对照组（n=30）0.025±0.007 0.840±0.141 0.026±0.005肺癌（n=23）1.771±0.140a 0.139±0.040a 1.478±0.202a乳腺癌（n=22）1.551±0.071a 0.201±0.041a 1.771±0.091a结直肠癌（n=23）1.849±0.611a 0.072±0.048a 1.331±0.051a

2.3.3 不同癌种患者外周血 Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3检出率比较 不同癌种患者外周血Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3 检出率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

图4 各组研究对象Survivin相对表达量比较

图5 各组研究对象Survivin-2B相对表达量比较

图6 各组研究对象Survivin-△Ex3相对表达量比较

表3 不同癌种患者外周血Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3检出率比较[n（%）]

3 讨 论

肿瘤是一种多基因疾病，目前，已发现的与肿瘤相关基因达500种以上，肿瘤病因的复杂性和多样性决定了肿瘤研究工作的艰巨性。肿瘤的早期发现、早期诊断、早期治疗是降低死亡率，改善患者预后的关键所在。

肿瘤标志物是由肿瘤细胞本身所产生的或由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质[1]。外周血肿瘤标志物的检测具有无创伤、可重复、可于同一时间点进行多项指标检测等优点，是肿瘤诊断和随访的理想手段[2]。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的最新成员，是1997年耶鲁大学GARZON等[3]利用效应细胞蛋白酶受体-1 cDNA在人类基因组库中筛选分离出来的，因其具有强大的抗细胞凋亡功能，故被命名为“存活素或生存素”。

Survivin基因全长14.7 kb，是迄今发现作用最强的凋亡抑制蛋白之一，有研究探讨了Survivin在体外培养细胞中的表达，结果显示，60种人类肿瘤细胞株均有Survivin的表达，包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤等，其是人肿瘤细胞和正常组织细胞中表达有差异的蛋白质之一，这一特点可能使其成为肿瘤标志物之一[4]。由于Survivin在肿瘤发生和发展中具有重要作用，其也可能成为肿瘤基因诊治的理想靶点[5]。

魏霞等[6]采用逆转录PCR（RT-PCR）检测了活检组织Survivin mRNA的表达，46例肺癌组患者Survivin mRNA表达明显高于17例肺部良性疾病组。一项非小细胞肺癌的研究表明，患者体内Survivn表达率达85.0%[7]。Survivin基因可能为肺癌的诊断提供了新的方法[8]。王彬等[9]采集50例接受手术的胃癌患者癌变组织，通过RT-PCR检测Survivin mRNA的表达，结果发现，胃癌患者Survivin mRNA表达阳性率高达68.0%，提示Survivin或许可以作为胃癌早期诊断的重要分子标志物。王波[10]采集50例胃癌患者、20例胃良性病变患者及35例健康者外周血，采用RT-PCR检测Survivn mRNA的表达，结果显示，胃癌患者外周血Survivn mRNA表达量明显高于健康者及胃良性病变患者。李昌荣等[11]认为，采用实时定量RT-PCR检测外周血Survivin基因表达，可能是一种较理想的无创性早期诊断、评估胃癌患者预后的有效指标，有助于延长胃癌患者生存时间及改善其生活质量。有研究表明，肝细胞癌组织Survivin mRNA表达量明显高于其相应的癌旁组织及正常肝脏组织[12]。施朕善等[13]研究了116例结直肠癌患者，Survivin mRNA表达阳性率为76.7%。邢春瑶等[14]在42例宫颈癌患者的病变组织中检测出Survivin表达阳性率为100.0%，在乳腺癌中Survivin表达阳性率为70.0%。JHA等[15]通过RT-PCR检测发现，高达93.6%的乳腺癌患者Survivin高表达。张香连[16]研究表明，Survivin在乳腺癌患者外周血中表达水平明显高于乳腺良性肿瘤患者和健康妇女，提示Survivin是诊断乳腺癌的良好肿瘤标志物。

目前已发现，人Survivin通过不同的选择性剪接形成5种剪接变异体，编码5种不同的蛋白质，分别为Survivin、Survivin-2B、Survivin-3B、Survivin-△Ex3 和Survivin2α[17]。Survivin的不同亚型及不同的细胞定位可能导致其凋亡和抗凋亡之间的功能存在差异。Survivin-2B和Survivin-△Ex3在肿瘤的发展中显示了不同的作用，存在着复杂的调节平衡，这种平衡的调节在肿瘤的形成中具有重要作用[18]。

国外有文献报道，Survivin-△Ex3主要表达于恶性肿瘤，而Survivin-2B主要表达于良性肿瘤。张恩等[19]采用PCR对52例胃肠道肿瘤患者外周血Survivin-△Ex3 mRNA表达进行了检测，结果显示，肿瘤患者Survivin-△Ex3 mRNA表达高于对照组。另外，Survivin不同剪接变异体与肿瘤患者预后的关系也很复杂，据文献报道，在非小细胞肺癌患者中，Survivin-2B相对于Survivin-△Ex3的大量表达与Survivin-△Ex3相对于Survivin-2B的大量表达来说具有更好的预后[20]。

本研究通过qRT-PCR检测了90例不同癌种患者和30例健康体检者外周血Survivin及其剪接变异体的表达，其中扩增结直肠癌标本23例，胃癌标本22例，乳腺癌标本22例，肺癌标本23例，结果显示，肿瘤患者Survivin、Survivin-△Ex3较对照组显著高表达，而Survivin-2B较对照组显著低表达。

有研究表明，在不同癌种患者中Survivin及其剪接变异体——Survivin-2B、Survivin-△Ex3表达是不同的，目前，肿瘤检测研究大多针对活体组织，创伤大，通过静脉采血的方式检测外周血Survivin及其剪接变异体——Survivin-2B、Survivin-△Ex3的表达，且通过实验表明，Survivin作为肿瘤标志物与肺癌、乳腺癌、结直肠癌和胃癌常用的标志物比较，灵敏度较高。这种无创、简单检查的高灵敏度非常适合具有高复发率的肿瘤疾病，使Survivin及其剪接变异体可能成为检测肿瘤的标志物之一，也可作为肿瘤标记分子及预后的检测指标应用于临床，具有良好的研究及应用前景。