蝇蛆抗菌肽及其在动物生产中的应用

付 杰， 宋京易， 任冠朋， 朱健， 冯兴军*

（1东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨 150030；2东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030）

蝇蛆是蝇类的幼虫，常年生活在非常腐败污秽的环境中却可以很好的生存繁衍，表现出极端环境下比其他动物更强的抵抗力，其体内的抗菌肽起到关键作用。蝇类抗菌肽是由核糖体合成，并且种类繁多，在蝇类体液免疫中发挥着重要作用。相比于传统抗生素，其独特的作用机制不但不宜产生耐药性，还能高效的杀灭耐药菌株。蝇蛆抗菌肽作为饲料添加剂可以有效促进畜禽生产性能、抗病力等。蝇蛆抗菌肽的开发利用对寻求饲用抗生素替代品、促进畜牧业绿色发展具有重要的理论和现实意义。

1 蝇蛆抗菌肽的种类

抗菌肽数据库（APD）目前包含2961个抗菌肽，其一级结构之间差异很大。迄今为止，已经分离的蝇类抗菌肽多达40种。根据蝇蛆抗菌肽功能、氨基酸的组成和结构特点，可分为5类：天蚕素类、防御素类、富含脯氨酸的抗菌肽、富含甘氨酸的抗菌肽、抗真菌肽。

1.1 天蚕素类 天蚕素是人类发现的第一个抗菌肽，由瑞典科学家Boman等（1972）从惜古比天蚕的血淋巴中分离得到。主要特征是N、C端存在两性的α螺旋结构，不含半胱氨酸（Cys），不能形成分子内二硫键，也被称为线性α螺旋肽，热稳定性和酶稳定性很高。表1是目前已发现的蝇蛆天蚕素类抗菌肽，一般由30～42个氨基酸残基组成，分子质量约为5 kD，其中N端富含强碱性氨基酸呈强碱性，C末端富含疏水氨基酸构成疏水区，此外C端氨基酸多数酰胺化，这可能与其抗菌活性有关（Yi等，2014），此类抗菌肽一般对革兰氏阴性和革兰氏阳性都有抑制作用，可抑制真菌的较少，只在黑腹果蝇体内提取的Cecropin A，B（Ekengren等，1999）和在厩螫蝇体内提取的Stonoxyn（Boulanger等，2002）对真菌具有抑制作用。

表1 蝇蛆天蚕素类抗菌肽

1.2 防御素类 蝇蛆防御素抗菌肽典型特点是由一个α螺旋和反向平行的β折叠构成，富含6个保守的半胱氨酸，构成多个C-O-O-O-O-C或C-O-C类结构（O是任意氨基酸），通过分子内形成的三个二硫键使α螺旋更加稳定，其中两个连接C端的α螺旋和β折叠，第三个连接N端环和第二个β折叠（Koehbach等，2017）。表2是目前已发现的蝇蛆防御素类抗菌肽，氨基酸残基数一般为34～46，阳离子型，分子质量为4～6 kD，主要作用于革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性细菌、真菌及真核细胞没有明显杀伤力。但发现在厩螫蝇（Lehane 等，1997）产生的 Smd1、Smd2 和褐尾麻蝇 （Matsuyama等，1988）体内产生的Sapecin A，B对革兰阴性菌起到抑制作用。

表2 蝇蛆防御素类抗菌肽

1.3 富含脯氨酸的抗菌肽 已发现的此类抗菌肽相对较少，分子质量为1.5～4 kD，氨基酸组成为10～30，不仅脯氨酸含量很高（25%以上），而且部分精氨酸的含量也比较高。表3是目前发现的富含脯氨酸的蝇蛆抗菌肽。其对革兰氏阴性菌的作用明显高于阳性菌，宫霞等 （2009）在研究MDL-2对细胞膜的通透性时发现，作用于大肠杆菌120 min时渗透率达50%，金葡萄球菌仅26%，当240 min时，大肠杆菌的渗透率达100%，金葡萄球菌仅有66%。此类抗菌肽根据氨基酸数目一般分为长链和短链两种，长链的如家蝇Diptericin（79AA）（柳峰松等，2009）、MDL-2（106AA）（宫霞等，2009）；短链的如从家蝇中分离纯化出MD-pep9，只含有 9个氨基酸（唐丽亚，2009）。

表3 蝇蛆富含脯氨酸类抗菌肽

1.4 富含甘氨酸的抗菌肽 此类蝇蛆抗菌肽也相对较少，一般半胱氨酸含量很少或没有，不形成二硫键，其一级结构中富含甘氨酸（10%～22%），有些肽链的某一区域全是甘氨酸（Gly）。目前在桔小实蝇、家蝇等发现此类抗菌肽存在（表4）。陆婕等（2010）从果蝇蛆中分离纯化的SK84，分子质量9338 Da，含有13个甘氨酸占15.5%，其中在13～18位点构成连续的6个甘氨酸域；党向利等（2012）从桔小实蝇蛹中分离出Bactrocerin-1和Bactrocerin-2，分子质量仅有2.3 kD，是目前已知蝇类富含甘氨酸中最小的，均含有20个氨基酸，其甘氨酸含量分别为15%和10%。此外，陆婕等（2006）从蝇蛆中鉴定出的MD7095也富含甘氨酸，是目前发现的少有的阴离子型抗菌肽之一。

表4 蝇蛆富含甘氨酸类抗菌肽

1.5 抗真菌肽 此类抗菌肽大多数在结构可分为上述四类结构，但上述四类绝大多数只对细菌具有显著的抑制作用，而对真菌无明显作用，而此类抗菌肽一般对细菌、真菌都有广谱高效抑制作用，故单独分类。Lijima等（1993）从麻蝇血淋巴中分离纯化出第一个抗真菌肽AFP-1，含有67个氨基酸，其中45个是甘氨酸和组氨酸（His），比例高达51%，在盐溶液和蒸馏水中显示出高效的杀真菌活性，但只有与呋喃西林联合作用才抑制白色念珠菌的生长。Gao等（2017）从家蝇蛆中分离出MAP17，含有143个氨基酸残基，是目前少有的大分子抗菌肽之一，对白色念珠菌也起到抑制作用。除此之外，目前在蝇类发现的抗真菌肽还包括 drosomycin （Fehlbaum 等，1994） 和 Metchnikowin（Levashina 等，1995）

2 蝇蛆抗菌肽的体外功能

2.1 抗菌 目前已发现的所有蝇类抗菌肽，对革兰氏阳性或阴性菌都有一定程度的抑制或杀灭作用，少数对真菌也有一定的抑制作用。郑学礼等（2007）通过针刺诱导家蝇蛆淋巴液产生的抗菌蛋白，对多种革兰氏阳性或阴性菌具有显著的抑制作用，并且联合氨苄青霉素，显著加强了家蝇血淋巴对白色葡萄球菌的抑制作用，当联合抗真菌药物氟康唑时对酵母的抑制作用也显著提高，表明抗生素和蝇蛆抗菌肽联合用药具有协同作用。此外 Feng 等（2015）和 PёOppel等（2015）发现，抗生素和抗菌肽联合用药或者多种不同AMPs组合可显著增强对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌抗菌活性，降低最小抑菌浓度，并有助于预防或延缓抗生素耐药性的出现。

研究表明，家蝇抗菌肽对大肠埃希氏菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等多种临床上易产生耐药性的病原菌有明显的抑制作用，蝇蛆AMPs若能被充分的发掘和利用，这将会在治疗临床感染性疾病，尤其在治疗耐药菌感染的疾病中起到关键性作用（周义文等，2004）。

2.2 抗肿瘤 近年来，蝇蛆抗菌肽的抗癌作用也是一个研究热点。蝇类抗菌肽能特异性抑制某些肿瘤细胞，而对正常哺乳动物细胞无不良作用。Akiyama等（2000）发现蝇类抗菌肽对小鼠移植的乳腺癌细胞有显著的抑制作用；陆婕（2010）提取的家蝇蛆富含甘氨酸的SK84抗菌肽，对THP-1、MCF-1、HepG2等癌症细胞具有明显的抑制作用。使用扫描电镜发现35μM的SK84处理人白血病THP-1细胞24 h后，癌细胞膜发生破坏，推测SK84通过柔性的N-端富含甘氨酸的区域形成弹性结构来干扰细胞膜。金小宝等（2011）通过激光共聚技术和扫描电镜观察蝇蛆抗菌肽Cecropins作用后的人源性肝癌细胞BEL-7402，发现BEL-7402细胞膜表面微绒毛消失，Cecropin与BEL-7402细胞膜结合，部分Cecropin会连续不断穿过细胞膜到达细胞内部，引起细胞凋亡。程璟侠等 （2012）发现蝇类抗菌肽存在质量浓度阈值，只有在高浓度作用下，慢性髓性白血病K562细胞膜才发生损伤，从而抑制K562细胞的生长。此外，焦莉萍（2013）发现蝇蛆抗菌肽MD可使肝癌细胞HepG2在G1期停滞，且不能进入S期，从而抑制S期DNA合成，表明其作用方式可能是通过影响细胞周期从而抑制HepG2的生长。

2.3 抗病毒 研究证实，抗菌肽结合病毒粒子，从而抑制病毒的繁殖和生长。Chernysh等（2002）从红头丽蝇蛆血淋巴中分离纯化出抗病毒肽Alloferon1，小鼠体内试验证明，Alloferon1对肝炎病毒、甲型、乙型流感病毒和慢性髓性白血病K562细胞有明显的抑制作用；Alloferon1可通过诱导机体产生干扰素（IFN）和激活自然杀伤细胞（NK），从而抑制病毒的代谢过程，阻断病毒吸附于机体细胞，提高了机体免疫力。艾辉等（2013）提取的蝇蛆清蛋白在0.5 mg/mL的低浓度下对禽流感病毒H9N2（AIV）、首稽银蚊夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）和家蚕核型多角体病毒（BmNPV）有高抗病毒活性。王芙蓉等（2006）发现15μL的家蝇幼虫抗菌肽粗提液对流感病毒的抑制率为72.41%，而30μL剂量组对病毒的杀灭率达到80%以上。这些抗病毒试验表明，蝇类抗菌肽有潜力成为天然抗病毒药物开发的良好来源。

2.4 调节免疫与消炎 抗菌肽的作用不仅在于直接杀灭入侵机体的病原微生物，而且能够在机体免疫反应过程的不同时期表现出强大作用。

绝大多数的蝇蛆抗菌肽都是阳离子型抗菌肽，通过静电吸附作用与带有负电荷的免疫原聚合，抑制其抗原性，阻断其对机体的免疫刺激。抗菌肽在机体内可中和脂多糖（LPS），降低其毒性作用，还可以抑制生物体内炎症因子的产生，减轻炎症反应（张晓宇等，2017）。此外，蝇类抗菌肽还能促进宿主天然免疫的其他反应，如Ai等（2013）发现蝇蛆抗菌肽能促进小鼠免疫器官的生长，在非特异性免疫中显著增强了吞噬细胞 （中性粒细胞、巨噬细胞）的吞噬作用和血清溶血活性，在特异性免疫中显著促进小鼠脾脏刀豆蛋白A和未活化的T淋巴细胞、LPS诱导的B淋巴细胞增殖。

2.5 其他功能 蝇蛆抗菌肽具有广谱的抗菌活性、抗病毒、抑制或杀灭肿瘤细胞，广泛参与机体的免疫调节功能，还具有机体抗氧化 （Ai等，2009）、抗动脉粥样硬化（Chu 等，2011）、肝保护（Wang等，2007）等多种生物学功能。

3 蝇蛆抗菌肽的诱导与分离纯化

蝇蛆抗菌肽的分离纯化是深入研究其结构和性质的基础与前提。但对未知蝇蛆抗菌肽的分离纯化难度很大，过程复杂。在分离纯化过程中，首先要保证蝇蛆抗菌肽的活性，其次要保证所分离组分单一。目前，蝇蛆抗菌肽分离纯化的原则是维持其生物活性，充分利用其物理化学及生物学性质（如分子量、热稳定性、酸碱稳定性、电荷特征、疏水性等）的不同设计纯化技术方案。

3.1 诱导蝇蛆抗菌肽的表达 蝇蛆抗菌肽分子量小，含量通常在微克级。一般采用体外诱导的方式促使其免疫体系做出应答，从而表达出大量的蝇蛆抗菌肽。目前蝇蛆抗菌肽的诱导方式主要有体壁损伤、热激、针刺诱导、超声诱导、带菌针刺诱导、细菌培养法。但不同的诱导源产生的抗菌活性有明显的差别，适当刺激有助于抗菌活性的增强，过度刺激不能增强活性，同时也发现多种刺激源相结合比单一刺激源刺激更有助于抗菌肽的表达（黄伟光，2011）。众多研究表明，蝇蛆抗菌肽的诱导表达量除了与诱导源有关，还与诱导处理时间有关。安春菊（2004）在探究诱导最佳时间时，设置6、12、24、48、65 h 五个组别， 发现其抗菌活性表现出明显差异。这些研究表明，蝇蛆抗菌肽诱导表达需要最佳刺激强度和时间。

3.2 蝇蛆抗菌肽的分离纯化

3.2.1 蝇蛆抗菌肽的初提目前蝇蛆抗菌肽的初步提取是依据其理化性质，通常采用适当的提取液将组织匀浆浸提，高速离心、热处理、酸碱处理、超滤、透析、硫酸铵沉淀法和等电点沉淀法等对样品进行初步分离。通过初步处理能除去样品中大分子、热稳定性和酸碱稳定性不好的蛋白质，同时也除去了脂肪和颗粒物。但蝇蛆抗菌肽粗提物除含有抗菌肽成分外，其他大部分为其他种类的多肽及蛋白质分子，要获得具有生物学功能的抗菌肽分子，需进一步分离纯化。

3.2.2 蝇蛆抗菌肽的精提蝇蛆抗菌肽粗提物一般通过分子筛、离子交换色谱等方法进一步分离。其原理分别是利用蝇蛆抗菌肽和其他杂质的分子量和带电情况的差异。分离纯化的蝇蛆抗菌肽纯度鉴定一般采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电聚焦电泳（IEF）和毛细管电泳（CE）。如分离纯化的酸性抗菌肽SK84，其分离纯化步骤为：沸水浴处理10min，稀醋酸低温浸提—海藻酸吸附—酸处理低温洗脱—盐析结晶—Sephadex G25凝胶过滤—弱阳离子交换柱层析—反向高效液相色谱—SDS-PAGE鉴定 （陆婕等，2010）。冉林等（2017）通过稀醋酸冰浴浸提—热处理—高速离心—真空冻干—凝胶过滤色谱Sephadex G-50柱分离—阳离子交换树脂CMSepharose Fast Flow柱吸附分离—凝胶过滤色谱Sephadex G25柱脱盐、分离—反相高效液相色谱分离纯化，分离出单一活性组分，分子量质2570 D。唐丽亚（2009）基于细胞膜结合原理建立了一种分离蝇蛆抗菌肽的方法，利用抗菌肽与细菌细胞膜之间的结合的属性，通过凝胶过滤比较与细菌结合的和未结合的蝇蛆干粉粗提物的洗脱峰，快速、准确的找到目标蝇蛆抗菌肽，最后通过反向高效液相色谱纯化，分离出MDpep5、MDpep9两个蝇蛆抗菌肽，从而摆脱了一般分离技术的多步层析和电泳联用技术的繁琐，步骤相对简单，蝇蛆抗菌肽活性得以良好地保持。

4 蝇蛆抗菌肽在动物生产中的应用

蝇蛆体内存在高表达量的抗菌肽，目前国内外通过将家蝇蛆或蝇蛆粉应用于动物生产，在预防、治疗动物疾病和促进动物体生长性能方面取得了不错的效果。

4.1 单胃动物

4.1.1 猪由于仔猪肠道正处于发育阶段，消化酶系发育不完善，消化功能不健全，自身免疫低下，体温调节机能差，断奶后会出现一系列问题，如采食量下降，抵抗力下降、生长受阻、腹泻等。其中腹泻是造成猪业经济损失的重要因素（彭凯等，2015）。郭礼荣等（2013）在仔猪饲喂期全程添加1%的蝇蛆抗菌肽，结果显示试验组生长速度明显提高，在断奶28 d，蝇蛆抗菌肽饲喂组比对照组多增重500 g，仔猪的腹泻率显著低于对照组，料肉比显著降低。

4.1.2 鸡众多研究表明，抗菌肽部分或全部取代抗生素作为饲料添加剂可有效提高鸡的生产性能和机体免疫力。表5列举了一些蝇蛆抗菌肽在鸡养殖中的应用情况。

表5 蝇蛆抗菌肽在鸡养殖中的应用

4.2 牛奶牛乳腺炎是乳腺组织由于病原微生物入侵引起的的炎症，是影响奶牛生产的重要因素。邹锋（2007）通过外敷蝇蛆抗菌肽凝胶制剂治疗奶牛乳腺炎，对临床型乳房炎治愈率达到60%，有效率（包括治愈和好转）高达85%，与青、链霉素合用时有效率高达100%，其治愈率和有效率均高于其他给药组。治疗隐形乳房炎治3 d时治愈率达到74%，总有效率达到88%，外敷第7天时治愈率高达90%，有效率94%，表明蝇蛆抗菌肽对两种奶牛乳房炎均有高效的治愈率。研究表明蝇蛆抗菌肽可以成为在规模化奶牛场中治疗奶牛乳房炎的有效途径。

4.3 水产动物随着水产养殖集约化和养殖模式工厂化的快速发展，养殖疾病逐年提高，水体生态逐年恶化，抗生素等药物残留和耐药病菌等问题逐年突出。抗菌肽作为新型高效无残留的饲料添加剂，可以有效的解决这类问题，并提高水产动物的抵抗力、免疫力和增重率，保证水产品质量。对虾白斑综合征病毒（WSSV）是目前已知所有对虾病毒中毒害能力最强、危害最大的病毒之一。李林等（2015）在基础饲料中按比例添加4种不同浓度的抗菌肽提取物，结果显示，在40、80 mg/kg浓度相对保护率达到42.42%、33.33%，显著降低了凡纳滨对虾感染WSSV后的累积死亡率。陈冰等（2010）研究发现蝇蛆抗菌肽可促进凡纳滨对虾体矿物质、蛋白质代谢，改善对虾的营养品质，显著提高对虾的成活率、增重率、特定生长率和饲料效率。陈红等（2015）研究结果表明饲料中添加适量蝇蛆抗菌肽，可促进日本鳗鲡幼鳗的生长，提高其成活率，降低养殖成本。同时蝇蛆抗菌肽在黄颖鱼（陈平洁等，2007）和鳙鱼中（丘继新等，2014）的应用也取得了良好的结果。

5 展望

在自然界中蝇蛆数量繁多，培养条件简单易行，其体内存在高表达量的抗菌肽。相比于传统抗生素，抗菌肽抗菌谱广，不宜产生耐药性，对耐药菌也有杀伤作用。未来如能对蝇蛆抗菌肽的提取、结构、功能和作用机制深入研究，为规模化提取或科学人工合成抗菌肽提供依据，从而为其在医疗、食品和畜牧业中代替抗生素提供有效可行的解决方案。