TurboFlow在线净化—液相色谱—串联质谱法测定畜禽肉中20 种（氟）喹诺酮类兽药残留量

王炳玲 田霁昕 项佳林 艾连峰

摘 要：建立TurboFlow在线净化-液相色谱-串联质谱测定畜禽肉中20 种（氟）喹诺酮类药物（（Fluoro）quinolones，（F）QNs）残留量的分析方法。样品用甲醇-乙腈（1∶1，V/V）进行均质提取，Cyclone-p在线净化柱净化富集提取液中的（F）QNs，然后将富集所得分析物洗脱，转至Hypersil Gold C8分析柱，经色谱分离后，用串联质谱检测。结果表明：西诺沙星、伊诺沙星和丹诺沙星在0.2～20.0 ng/mL的线性范围内线性良好，其余17 种（F）QNs在0.1～10.0 ng/mL的线性范围内线性良好，且R2均大于0.99；西诺沙星、伊诺沙星和丹诺沙星的定量限为

2 ?g/kg，其余17 种（F）QNs为1 ?g/kg；20 种（F）QNs在3 个水平的添加回收率为85.4%～108.2%，相对标准偏差为4.04%～8.57%。方法简单、快速、回收率高、重复性好，适用于动物源食品中（F）QNs的定量及确证检测。

关键词：TurboFlow在线净化液相色谱；串联质谱；（氟）喹诺酮类药物；残留；畜禽肉

Determination of 20 （Fluoro） Quinolones Residues in Livestock and Poultry Meat by TurboFlow Online

Cleanup-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Bingling1， TIAN Jixin2， XIANG Jialin1， AI Lianfeng1，*

（1.Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Shijiazhuang 050051， China；

2.College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

Abstract： A new method was developed for the determination of （fluoro）quinolones （（F）QNs） residues in livestock and poultry meat using TurboFlow online cleanup （TFC）-liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）. Samples were extracted with methanol-acetonitrile （1 ： 1， V/V） mixture. Then the extract was purified on a Cyclone-p column. Subsequently， the analytes were separated on a Hypersil Gold C8 column before being analyzed by tandem mass spectrometry. The calibration curves showed good linearity with R2 > 0.99 in the concentration range from 0.2 to

20.0 ng/mL for cinoxacin， enrofloxacin and danofloxacin， and in the range from 0.1 to 10.0 ng/mL for 17 other （F）QNs. The limit of quantization for enrofloxacin， danofloxacin and cinoxacin was 2 μg/kg， while that for 17 other （F）QNs was 1 μg/kg. Average recoveries of the analytes fortified at three levels ranged from 85.4% to 108.2%， with relative standard deviations （RSDs） between 4.04% and 8.57%. The method was characterized by simplicity， rapidity， high recovery and good repeatability and was suitable for quantitative analysis and confirmation of （F）QNs residues in foods of animal origin.

Keywords： TurboFlow online cleanup-liquid chromatography； tandem mass spectrometry； （fluoro） quinolones； residue； livestock and poultry meat

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805006

中圖分类号：S859.84 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）05-0030-09

引文格式：

王炳玲， 田霁昕， 项佳林， 等. TurboFlow在线净化-液相色谱-串联质谱法测定畜禽肉中20 种（氟）喹诺酮类兽药残留量[J]. 肉类研究， 2018， 32（5）： 30-38. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805006. http：//www.rlyj.pub

WANG Bingling， TIAN Jixin， XIANG Jialin， et al. Determination of 20 （fluoro） quinolones residues in livestock and poultry meat by turboflow online cleanup-liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2018， 32（5）： 30-38. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805006. http：//www.rlyj.pub

（氟）喹诺酮类药物（（Fluoro）quinolones，（F）QNs）

是人工合成的含有4-喹酮母核的一类广谱抗菌药物，因其具有抗菌谱广、高效、吸收好、组织浓度高、半衰期长等优点，已成为兽医临床和畜禽水产养殖中最重要的抗感染药物之一[1]。（F）QNs在食用动物饲养中的广泛应用必然导致其在食用组织中的残留问题，而残留的（F）QNs容易诱导人类的病原微生物对其产生耐药性[2]，

因此，（F）QNs的残留问题已引起广泛关注。美国禁止在食用动物养殖中使用（F）QNs；世界卫生组织、欧盟及日本等国家和组织都将（F）QNs列入限制使用的兽药名单中，并规定了相应的最高残留限量；我国于2002年规定环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、丹諾沙星（danofloxacin，DAN）、恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）、沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）、二氟沙星（difloxacin，DIF）、恶喹酸（oxolinic acid，OXOA）及氟甲喹（flumequine，FLU）7 种（F）QNs在动物肌肉组织中的最高残留限量为10～500 μg/kg[3-7]。

目前，液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术日臻完善，高选择性、高灵敏度以及高通量等特性使其特别适合用于残留分析，现已成为兽药残留分析的首选检测方法之一，在（F）QNs残留分析中的应用较多[8-14]，应用领域也非常广泛，检测的样品包括环境中的水、土壤、食品中的蜂蜜、肉、蛋、乳等。但LC-MS/MS的前处理过程复杂繁琐，所需工作量较大，且成本较高。多数样品的前处理方法都需要经过SPE小柱的手动净化富集[15-18]或是引入QuEChERS技术[19-20]才能达到残留检测的要求，动物源食品的测定甚至还需要在固相萃取前加上脱脂这一步骤[21-23]。提取净化步骤的增加不仅使检测方法更加繁杂、分析效率降低，而且分析步骤越多，不同结构类型的多种分析物同时达到符合残留分析规定要求的技术指标难度越大，准确度很难保证。

TurboFlow在线净化技术以多孔大粒径的填料为吸附剂，不同类型的净化柱键合不同的化学基团，这种在线净化柱结合了扩散作用、体积排阻作用和化学作用，通过改变流动相配比和选择不同功能的色谱柱，大分子杂质先被洗脱出净化柱，而有机小分子药物被吸附富集，快速实现在线净化和分析检测。该技术已成功应用于食品中化学污染物的分析检测，例如，其在动物源食品中金刚烷胺的残留检测以及药物中真菌毒素的快速测定等方面均有很好的应用[24-27]。本研究运用TurboFlow在线净化-LC-MS/MS技术结合同位素内标方法[28-30]测定畜禽肉中20 种（F）QNs的残留量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品：吡哌酸（pipemidic acid，PIPA，纯度99.0%）、伊诺沙星（enoxacin，ENO，纯度99.0%）、麻宝沙星（marbofloxacin，MAR，纯度99.0%）、诺氟沙星（norfloxacin，NOR，纯度99.0%）、氟罗沙星（fleroxacin，FLE，纯度98.0%）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL，纯度99.0%）、CIP（纯度94.0%）、培氟沙星（pefloxacin，PEF，纯度99.0%）、盐酸洛美沙星（lomefloxacin hydrochloride，LOM，纯度99.0%）、DAN（纯度94.0%）、ENR（纯度99.0%）、奥比沙星（orbifloxacin，ORB，纯度99.0%）、西诺沙星（cinoxacin，CIN，纯度99.5%）、加替沙星（gatifloxacin，GAT，纯度98.0%）、SAR（纯度97.0%）、司帕沙星（spatfloxacin，SPA，纯度99.0%）、OXOA（纯度98.3%）、DIF（纯度96.0%）、萘定酸（nalidixic acid，NALA，纯度99.5%）和FLU（纯度98.3%），均购于德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

内标化合物：氘代诺氟沙星（norfloxacin-D5，NOR-D5，纯度99.4%）、氘代环丙沙星（ciprofloxacin-D8，CIP-D8，纯度99.5%）和氘代恩诺沙星（enrofloxacin-D5，ENR-D5，纯度99.0%）均购于德国Witega公司。

甲酸、异丙醇、乙腈、丙酮和甲醇均为色谱纯，水为Milli-Q高纯水。

猪肉及鸡肉样品均购自本地超市。

1.2 仪器与设备

TurboFlow在线净化TSQ Quantum Ultra LC-MS/MS仪（由CTC多功能自动进样器（配备100 ?L定量环）、2 个耐压1.25×105 kPa的四元梯度液相泵、六通阀切换装置、多元柱切换装置和TSQ Quantum Ultra三重四极杆质谱仪组成） 美国ThermoFisher公司；3K-15离心机

德国Sigma公司；PT2100均质器 瑞士Kinematica

公司；Milli-Q纯化系统 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

准确称取约5.00 g样品，置于50 mL离心管中，加入内标混合液（1 ?g/mL，125 ?L）和25 mL甲醇-乙腈溶液（1∶1，V/V），均质1 min，4 000 r/min条件下离心10 min；取1 mL左右上清液，于45 ℃条件下氮吹至干，用1 mL 0.5%甲酸水溶液溶解，溶解液经0.22 ?m微孔滤膜过滤后进样测定。

1.3.2 在线净化色谱条件

在线净化程序主要为净化和分离过程，净化过程（TurboFlow chromatography，TFC）由上样泵驱动净化流动相在TurboFlow柱上完成，分离过程（LC）由分离泵驱动分析流动相在分析柱上完成。整个程序通过2 个六通阀的切换使流路改变，实现在线净化富集。

净化柱为Cyclone-p柱（0.5 mm×50 mm，60 μm，60 ?），流动相A为0.5%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相C为丙酮-乙腈-异丙醇溶液（1∶1∶1，V/V），

进样量80 μL。LC仪的分析柱为Hypersil C8柱（2.1 mm×150 mm，5 μm），流动相A为0.5%甲酸水溶液，流动相B为乙腈。TurboFlow在线净化梯度洗脱程序如表1所示，其中TFC每步的变化均采用瞬变模式，HPLC除最后一步采用瞬变模式外，其他步骤间的改变均采用渐变模式。TurboFlow在线净化流路切换模式示意图如图1所示。

1.3.3 质谱条件

电喷雾离子源；多反应监测正离子扫描模式；鞘气压力40 psi；辅助气压力30 psi；离子源温度350 ℃；电喷雾电压3 500 V；源内诱导解离电压10 V；毛细管温度350 ℃；四级杆1、四级杆3单位分辨率0.7。优化得到其他测定条件。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

（F）QNs为两性化合物，随结构的不同化学性质略有差别。本研究分别采用甲醇、乙腈、1%甲酸甲醇、1%甲酸乙腈和甲醇-乙腈（1∶1，V/V）作为提取溶剂，比较各溶剂的提取效果。结果表明：对于极性稍强的化合物，如PIPA、ENO、MAR、NOR、FLE和OFL，甲醇的提取效果最佳，回收率與其他3 种溶剂相比较高；而对于极性稍弱的OXOA、DIF、NALA和FLU，乙腈的提取效果最佳；对于其他化合物，甲醇和乙腈的提取效果相当，略高于酸性的甲醇和乙腈。综合考虑实验结果，本研究采用甲醇-乙腈（1∶1，V/V）作为提取溶剂，基质外标法校正的回收率均高于80%。

2.2 TurboFlow在线净化条件的优化

TFC在线净化过程主要包括上样、洗脱转移、淋洗和条件化。本研究采用不接分析柱，分流进质谱方式优化每一步的在线净化条件。

在上样步骤，本研究选择0.5%甲酸溶液作为上样流动相，对阳离子在线净化柱（Cyclone MCX）和反相混合基质在线净化柱（Cyclone-p）进行考察。结果表明，在Cyclone MCX柱上20 种目标化合物不能完全保留，而在Cyclone-p柱上20 种目标化合物均能有效保留，且在洗脱转移一步能够被完全洗脱，故选择Cyclone-p作为在线净化柱，0.5%甲酸溶液作为上样流动相。

洗脱转移时需选择合适的洗脱液，既要保证分析物被完全洗脱又不能影响分析物在分析柱上的分离。Cyclone-p为反相萃取柱，高比例的有机溶剂是洗脱的保证。洗脱环体积为200 ?L，洗脱时将净化流路和分析流路合并，为稀释洗脱溶液，净化流路的流速较低（0.1 mL/min），分析流路的流速较高（0.5 mL/min）。在此条件下，采用不同比例的0.5%甲酸溶液与乙腈混合液洗脱目标化合物，结果表明，当混合洗脱液中乙腈的比例高于60%时，20 种目标化合物能够完全洗脱，但过高比例的乙腈会影响目标化合物的峰型，当混合洗脱液中乙腈的比例高于80%时，目标化合物的峰型明显变宽且拖尾现象严重。因此选择乙腈-0.5%甲酸溶液（60∶40，V/V）作为洗脱溶剂。

由图2可知，上样过程基本没有损失，洗脱环中的溶液可以完全洗脱分析物（2 min内）。

淋洗和条件化是目标化合物在分析柱分离和质谱检测过程中，由净化泵带动洗脱能力较强的溶剂对TFC柱进行淋洗，并用洗脱溶剂充满洗脱环，以备下一个样品的分析。本研究选择丙酮-乙腈-异丙醇（1∶1∶1，V/V）作为强洗脱溶剂，充分淋洗TFC柱，然后用0.5%甲酸进行初始化。

2.3 质谱条件的优化

用蠕动泵以10 μL/min的速率注入1 μg/mL的混合标准溶液，确定各化合物的最佳质谱条件，包括选择特征离子对、优化电喷雾电压、鞘气、辅助气、碰撞能量等条件。各化合物的混合标准溶液和内标混合液进入电喷雾电离源，分别在正、负离子扫描模式下进行一级全扫描质谱分析，得到分子离子峰。结果表明，各化合物均在正离子模式下有较高的响应值，负离子模式下响应值很低。然后对各分子离子峰进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，根据响应值的大小确定定性、定量离子。优化后目标化合物的参考保留时间、母离子、子离子和碰撞能量如表2所示。

2.4 方法的线性和基质影响

根据每种（F）QNs的灵敏度，用甲醇配制一系列标准工作溶液，用鸡肉空白样品的提取液配制一系列基质标准工作溶液，在优化后的条件下进行测定。其中，ENO、DAN和CIN系列标准工作溶液的质量浓度均分别为0.2、0.5、2.0、5.0、20.0 ng/mL，其余（F）QNs系列标准工作溶液的质量浓度均分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 ng/mL。用目标化合物的峰面积与选定内标化合物的峰面积比率对标准工作溶液中相应组分的质量浓度作图。

由表3可知，不同基质对分析物测定的影响不同。猪肉样品同样存在基质影响，需要用空白样品提取液作为基质绘制标准曲线方程。对于CIP、NOR和ENR，因其有同位素内标，校正了基质影响，使得空白样品提取液作为基质的标准曲线方程与甲醇溶液作为基质的标准曲线方程相差不大；而其他化合物因没有相应的同位素内标，色谱共洗脱组分的干扰对其电喷雾离子化存在抑制作用，导致空白样品提取液作为基质的标准曲线方程响应值较低。虽然3 个同位素内标没有抵消掉所有化合物的基质影响，但可以校正提取和在线净化过程的损失，提高方法的回收率和精密度。综合考虑，本研究采用空白样品提取液作为基质的内标法定量分析目标化合物。

2.5 方法的特异性

分别对20 种（F）QNs进行测定，选择信号值较高的2 组二级质谱离子进行定性及定量分析。由图3可知，分析物均具有特征二级离子，辅之色谱分离，方法具有良好的选择性。对鸡肉和猪肉2 种基质的空白样品按优化好的方法进行分析，结果表明，均没有干扰组分影响方法的定性及定量分析。

2.6 方法定量限

根据优化所得色谱条件选取适当浓度，对鸡肉和猪肉空白样品进行20 种（F）QNs的添加实测，综合考虑样品的稀释体积、仪器方法的进样量和其他干扰情况，以10 倍信噪比确定方法的定量限。

由表3可知，除ENO、DAN和CIN的定量限为2 ?g/kg外，其余化合物的定量限均为1 ?g/kg，完全满足（F）QNs

残留分析的要求。

2.7 方法的回收率和精密度

用不含（F）QNs的鸡肉样品进行添加回收率和精密度实验。由表4可知，方法的回收率在85.4%～108.2%之间，3 个添加水平的相对标准偏差在4.04%～8.57%之间，方法回收率高，重复性好。用不含（F）QNs的猪肉样品进行添加回收率和精密度实验，方法的回收率在87.5%～110.4%之间，3 个添加水平的相对标准偏差在4.36%～9.02%之间，也具有良好的准确度和精密度。

2.8 实际样品检测

实验室已采用该方法检测了500余批次鸡肉、猪肉等畜禽肉样品，其中1 个样品检出有NOR残留。由图4～5可知，NOR的2 个特征离子对均出现，且丰度比与标准一致，因此判定测定结果为阳性，定量测定结果为54 ?g/kg。

3 结 论

将TurboFlow在线净化技术应用于畜禽肉中20 种（F）QNs

殘留量的检测中，采用甲醇-乙腈（1∶1，V/V）提取目标化合物，提取液经在线固相萃取净化，LC-MS/MS

测定。方法简单、快速、节约实验室成本和前处理时间，回收率高、重复性好，满足国内外的限量要求，适用于畜禽肉制品中（F）QNs残留的定量及确证检测，已应用于本实验室的日常检测工作。

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