糖尿病并发白内障患者晶状体前囊膜组织TGF-β表达、血清AGEs水平变化及意义

于卫东，赵颖，谭光明，李守杰，李晓赛，查玉梅，侯为开

(1沂水县人民医院，山东沂水276400；2山东大学齐鲁医院)

糖尿病患者易较早出现白内障，且病情进展迅速。长期高血糖可刺激机体内蛋白质、脂质发生非酶糖基化，引起多种异构体在人体内发生蓄积，临床上将其称为糖基化终产物(AGEs)[1]。AGEs能与细胞膜上的糖基化终产物受体结合，促进糖尿病患者白内障的发生与发展[2,3]。转化生长因子β(TGF-β)是一种调节细胞生长和分化的多肽，可通过影响晶状体上皮细胞引起晶状体前、后囊膜下发生纤维化，在白内障的发生过程中发挥重要作用[4]。2014年11月～2016年12月，本研究观察了糖尿病并发白内障患者晶状体前囊膜组织TGF-β表达、血清AGEs水平变化，现分析两者在糖尿病并发白内障中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择同期沂水县人民医院收治的糖尿病并发白内障患者20例作为观察组，男13例、女7例，年龄60～83(70.46±4.56)岁，糖尿病病程5～14(9.68±3.14)年，白内障病程1～7(4.15±1.04)年。纳入标准：①符合WHO 1998年制定的2型糖尿病诊断标准；②符合白内障诊断标准，即晶状体发生变性和混浊，变为不透明，以致影响视力。排除标准：①合并恶性肿瘤或严重心、肝、肾功能不全者；②合并其他眼部疾病者。选择同期收治的单纯白内障患者20例作为对照组，男11例、女9例，年龄61～84(69.73±4.49)岁，白内障病程1～8(4.01±1.00)年。对照组白内障诊断明确，空腹血糖均在正常范围(3.9～6.1 mmol/L)。本研究通过医院医学伦理委员会审核，患者及其家属均知情同意。

1.2 晶状体前囊膜组织TGF-β蛋白表达检测 采用Dot blot法。两组入院第二天均行常规白内障超声乳化人工晶状体移植术，术中取出晶状体囊膜。利用撕囊镊将其撕开，获得直径为5～7 mm的前囊膜组织，立即将其放入含RNase酶的EP管中，- 80 ℃保存备用。取出部分保存备用的晶状体前囊膜组织，充分研磨后加入细胞裂解液，抽取蛋白。加热使蛋白变形，取2 μL蛋白样品加入硝酸纤维素膜上，晾干后加入浓度为5%的胎牛血清封闭20 min。加入一抗(稀释比例1∶200)，常温下孵育30 min；加入PBS漂洗3次，加入二抗(稀释比例1∶500)，常温下孵育30 min。加入ECL化学发光，孵育1 min，X线胶片下曝光、显影、定影。采用ImagePro软件定量分析条带灰度值。每个样本重复实验2～3次，取平均值。

1.3 晶状体前囊膜组织TGF-β各亚型mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。取1.2中部分保存备用的晶状体前囊膜组织，充分研磨后采用TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA。TGF-β1上游引物：5′-AGCGACTCGCCAGAGTGGTTA-3′，下游引物：5′-GCAGTGTGTTATCCCTGCTGTCA-3′，引物长度293 bp；TGF-β2上游引物：5′-ACGGGGCGGGGCGGTGGA-3′，下游引物：5′-ACGGGGCGGGGCGGTGGA-3′，引物长度124 bp；TGF-β3上游引物：5′-GGGCTCATCGGAGTAACTTTCC-3′，下游引物：5′-TCTCTCGGTCATTCCCTTGG-3′，引物长度261 bp；内参β-action上游引物：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，引物长度118 bp。PCR扩增条件：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3mRNA相对表达量。

1.4 血清AGEs检测 采用ELISA法。两组入院第2天均留取空腹肘静脉血3 mL，离心后分离血清，-80 ℃保存备用。采用ELISA法检测血清AGEs水平，严格按照AGEs试剂盒使用说明书操作。试剂盒购自北京方程生物科技有限公司。

1.5 观察组晶状体前囊膜组织TGF-β表达与血清AGEs水平关系的分析 采用Pearson相关分析法分析观察组晶状体前囊膜组织TGF-β蛋白表达及其各亚型mRNA表达与血清AGEs水平的关系。

2 结果

2.1 两组晶状体前囊膜组织TGF-β蛋白表达及血清AGEs水平比较 观察组与对照组晶状体前囊膜组织TGF-β蛋白相对表达量分别为45 863.58±231.08、32 314.88±158.42，血清AGEs水平分别为(17.26±2.32)、(11.15±1.95)μg/L；两组比较P均<0.01。

2.2 两组晶状体前囊膜组织TGF-β各亚型mRNA相对表达量比较 观察组晶状体前囊膜组织TGF-β1mRNA相对表达量高于对照组，TGF-β2mRNA相对表达量低于对照组(P均<0.05)；两组晶状体前囊膜组织TGF-β3mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组晶状体前囊膜组织TGF-β各亚型mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3 观察组晶状体前囊膜组织TGF-β表达与血清AGEs水平的关系 观察组晶状体前囊膜组织TGF-β蛋白表达、TGF-β1mRNA相对表达量与血清AGEs水平均呈正相关关系(r分别为0.86、0.93，P均<0.01)，晶状体前囊膜组织TGF-β2mRNA相对表达量与血清AGEs水平呈负相关关系(r=-0.84，P<0.01)，晶状体前囊膜组织TGF-β3mRNA相对表达量与血清AGEs水平无明显相关性(P>0.05)。

3 讨论

糖尿病患者发生白内障的相关因子及调控机制仍不清楚。TGF-β是一种分泌型多肽信号分子，具有促进细胞外基质合成和组织修复、调节细胞增殖和分化等作用[5]。TGF-β有三种不同的亚型，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β1在细胞或组织中的含量最为丰富，主要与慢性炎症或纤维化相关。TGF-β2可表达于内皮细胞及神经细胞中，在上皮细胞的分化及成熟中发挥作用；TGF-β2可调控细胞外基质合成，抑制晶状体上皮细胞的增殖，对于维持眼的正常生理功能具有重要作用。中枢神经系统可产生TGF-β3，并且TGF-β3在间质细胞中亦有表达[6～9]。研究显示，TGF-β在糖尿病患者并发白内障的过程中发挥重要作用，TGF-β过度表达可能参与了糖尿病患者前囊膜下白内障的发生[10]。亦有研究显示，TGF-β细胞因子能通过诱导上皮-间质转化而参与白内障发生[11]。此外，TGF-β还可能通过增强纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、平滑肌肌动蛋白mRNA表达而发挥作用[12,13]。本研究结果显示，观察组晶状体前囊膜组织TGF-β蛋白表达明显高于对照组，提示晶状体前囊膜上皮细胞TGF-β表达升高在糖尿病患者并发白内障的过程中发挥重要作用。本研究两组各亚型mRNA表达均出现差异性，观察组晶状体前囊膜组织TGF-β1mRNA相对表达量高于对照组，TGF-β2mRNA相对表达量低于对照组，两组TGF-β3mRNA相对表达量比较差异无统计学意义。TGF-β1表达升高提示患者纤维化或炎症水平较为明显，TGF-β2表达降低提示患者晶状体上皮细胞增殖较为明显，说明TGF-β1、TGF-β2介导的纤维化或炎症水平加重及晶状体上皮细胞增殖共同参与了糖尿病并发白内障的发病过程。

AGEs是由还原糖在无酶催化下与蛋白质、脂质、核酸等反应生成的大分子物质，易积聚于各个组织、器官间隙[14]。AGEs在正常机体内的形成过程很缓慢，与蛋白质周转、组织结构、细胞氧化应激及炎症等均有关。研究表明，长期高血糖状态可以增强非酶糖基化作用，加速AGEs在晶状体的形成和积累，己形成的AGEs可能通过修饰蛋白质等直接作用或发生配体-受体作用启动细胞内信号转导，从而参与糖尿病并发白内障的发生、发展[15～18]。本研究结果显示，观察组血清AGEs水平明显高于对照组，说明血清AGEs水平升高可能与糖尿病患者并发白内障有关；观察组血清AGEs水平与晶状体前囊膜组织TGF-β蛋白表达、TGF-β1mRNA相对表达量呈正相关关系，与TGF-β2mRNA相对表达量呈负相关关系，与TGF-β3mRNA相对表达量无明显相关性，表明TGF-β与AGEs尤其是TGF-β1、TGF-β2亚型相互作用，二者可能共同参与了糖尿病并发白内障的发生、发展，也说明AGEs与TGF-β1、TGF-β2介导的纤维化或炎症水平加重及晶状体上皮细胞增殖共同参与了糖尿病患者并发白内障的发病过程。AGEs与TGF-β1、TGF-β2之间的相互作用及调控机制仍有待进一步细胞实验进行验证。

综上所述，糖尿病并发白内障患者晶状体前囊膜组织TGF-β蛋白表达、TGF-β1mRNA表达及血清AGEs水平均升高，晶状体前囊膜组织TGF-β2mRNA表达降低；TGF-β1、TGF-β2与AGEs可能共同参与了糖尿病患者白内障的发生过程。