肝豆灵对高铜负荷小鼠神经干细胞活性氧水平及核因子E2相关因子2表达的影响

董婷 杨文明 吴明彩 蒋怀周 黄鹏 匡春俊 张娟 韩辉

摘要：目的 观察肝豆灵对高铜负荷小鼠神经干细胞内活性氧（ROS）水平及核因子E2相关因子2（Nrf2） mRNA及蛋白表达的影响。方法 体外培养高铜负荷小鼠神经干细胞模型。实验小鼠随机分为空白对照组、模型组和肝豆灵低、中、高剂量组，各给药组给予相应浓度肝豆灵药物血清灌胃。采用MTT法检测神经干细胞增殖水平，流氏细胞仪检测细胞内ROS水平，qRT-PCR检测Nrf2基金表达，Western blot检测细胞内Nrf2蛋白表达。结果 与空白对照组比较，模型组小鼠神经干细胞增殖率显著下降，ROS水平明显升高，Nrf2基因、蛋白表达明显降低（P<0.01）；与模型组比较，肝豆灵各剂量组小鼠神经干细胞增殖率显著升高，ROS水平明显降低，Nrf2基因、蛋白表达明显升高（P<0.05，P<0.01）。结论 肝豆灵通过降低高铜负荷小鼠ROS含量、上调Nrf2的表达，从而促进小鼠神经干细胞的增殖。

关键词：肝豆灵；高铜负荷；体外培养；神经干细胞；活性氧；核因子E2相关因子2；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.013

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）07-0053-04

Abstract： Objective To observe the effects of Gandouling on reactive oxygen species （ROS） level， the expression of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2） mRNA and protein of neural stem cells of the mice cultured in high concentration copper. Methods The model of neural stem cells of the mice was cultured in vitro with high concentration copper. The experimental rats were randomly divided into blank control group， model group， and Gandouling low-， medium-， and high-dose groups. Each medication group was given relevant concentration of Gandouling serum for gavage. The MTT was adopted to test proliferation level on neural stem cells； flow cytometer was used to examine the change of ROS level in cells； qPCR was used to measure the expression of Nrf2 mRNA； Western blot was used to measure the change of the level of protein Nrf2 in cells. Results Compared with the blank control group， the proliferation rate of neural stem cells was significantly decreased， ROS levels were significantly increased， and Nrf2 gene and protein expression was significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， neural stem cells proliferation rate was significantly increased， ROS levels were significantly reduced， and Nrf2 gene and protein expression was significantly increased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Gandouling can promote the proliferation of neural stem cells in mice by reducing ROS content in high copper-loaded mice and up-regulating Nrf2 expression.

Keywords： Gandouling； high copper load； cultured in vitro； neural stem cells； reactive oxygen species； nuclear factor erythroid 2-related factor 2； mice

Wilson病是一种ATP7B基因缺陷所致的铜代谢障碍疾病，患者不能清除体内多余的铜，导致铜在肝脏等组织中沉积，甚至可能引起严重的中枢损伤。铜是一种强氧化剂，它可以激活自由基的活性，进而促进细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，细胞内铜过载，继而诱发的氧化应激，是大部分神经变性疾病致病的共同特征与机理。氧化应激产生的ROS从不同途径损伤了各种大分子的生理功能，并攻击特定脑组织区域的神经细胞，导致细胞发生凋亡，直至疾病发生。而对此类疾病，降低ROS引起的损害是治疗的关键，核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2），作为一类对抗氧化应激和保护細胞生存的转录因子，成为神经干细胞（neural stem cell，NSC）损伤修复的潜在机制之一。在Wilson病研究过程中，研究人员发现，神经干细胞（NSC）是高铜负荷的重要靶点之一，NSC的增殖受损将严重影响脑部神经细胞的再生能力，肝豆灵能抵抗高铜导致的NSC生长阻滞，发挥神经保护作用[1]。然而，作为肝豆灵重要靶点的NSC中发生分子变化机制不明，给精确解析肝豆灵的作用机理及开发新的药物靶点造成障碍。因此，本实验制备药物血清，体外建立及高铜培养NSC，观察肝豆灵对小鼠NSC的ROS和Nrf2的影响，探讨其对高铜诱导的NSC损伤小鼠的保护作用及其分子机制。

1 实验材料

1.1 动物

孕14 d ICR小鼠3只和SD大鼠40只（体质量200～220 g），SPF级，安徽省动物中心提供，动物许可证号SCXK（皖）2014-002，孕14 d ICR小鼠适应性饲养后取胚胎海马组织，分离并培养NSC。SD大鼠于专用清洁实验室饲养1周，温度25 ℃，相对湿度50%～70%，模拟自然昼夜循环光照的非直射光线。

1.2 药物

肝豆灵片，安徽中医药大学第一附属医院制剂（皖药制字Z20050071），规格0.3 g/片，批号20150522。

1.3 主要试剂与仪器

胰蛋白酶、DMEM/F12（1∶1）液体培养基（HyClone公司），胎牛血清（Gibco公司），无血清培养添加剂N2（Gibco公司），重组人表皮生长因子（Peprotech公司），重组人碱性成纤维细胞生长因子（Peprotech公司），噻唑蓝（Amresco公司），二甲基亚砜（Sigma公司），ROS检测试剂盒（Thermo Scientific公司），Trizol试剂（Invitrogen公司），反转录试剂盒（Promega公司），实时定量PCR试剂盒/SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Novoprotein公司），核蛋白提取试剂盒（Sigma公司），兔抗大鼠Nrf2单克隆抗体（Santa cruz公司），抗β-actin鼠克隆抗体（Santa cruz公司），抗大鼠Lamin B抗体（Santa cruz公司）。实时荧光定量PCR仪（美国AB公司），DU800紫外可见分光光度计（美国贝克曼公司），细胞培养箱2306-2（美国Shellab公司），倒置显微镜DMLL（德国徕卡），Odyssey双色红外荧光成像系统（美国LI-COR公司）。

2 实验方法

2.1 肝豆灵药物血清的获取

SD大鼠适应性饲养1周，随机分为空白对照组和肝豆灵药物血清低、中、高剂量组（肝豆灵低、中、高剂量组）。给药前大鼠禁食不禁水12 h，肝豆灵低、中、高剂量组分别给予0.48、0.96、1.92 g/（kg·d）肝豆灵药物血清灌胃，空白对照组大鼠给予等量体积纯净水灌胃。给药体积均为10 mL/（kg·d），连续3 d。于第4日灌胃给药2 h后取血，3500 r/min离心15 min，分离血清，置于56 ℃水浴锅灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，将肝豆灵各剂量组药物血清配制成浓度为10%药物血清培养液，低温贮存备用。

2.2 神经干细胞分离和培养

无菌条件下取孕14 d ICR小鼠胚胎海马组织，经胰蛋白酶解消化，转入含0.7 mg/mL卵蛋白的DMEM/F12（1∶1）液中机械吹散。低温2000 r/min离心细胞悬液5 min后洗涤沉淀，重悬细胞并调整活细胞浓度为5000～10 000/mL，进行悬浮培养。存活细胞以免疫细胞化学检查，以验证其均为Abcg2+的NSC。再将培养的NSC分为空白对照组、铜负荷模型组（模型组）和肝豆灵低、中、高剂量组。空白对照组在DMEM中加入10%SD大鼠空白血清，模型组用含10%SD大鼠空白血清铜负荷培养基（200 μmol/L工作浓度[1]）培養；肝豆灵低、中、高剂量组分别用3种不同剂量配制的10%肝豆灵药物血清铜负荷培养基培养。

2.3 MTT实验

分离培养的NSC接种于96孔培养板，细胞密度调整为1×104/孔，体积为100 ?L，每组设4个复孔，经药物血清培养后，加入MTT 20 ?L于37 ℃孵育4 h后收获细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清液。每孔沉淀加入二甲基亚砜150 ?L，温和低速振荡10 min，充分溶解结晶，于酶标仪波长490 nm处测吸光度（A），计算细胞增殖率。细胞增殖率（%）=A值实验组÷A值空白对照组×100%。

2.4 活性氧检测

采用CellROXTM Deep Red Flow Cytometry Assay Kit分离、收集和流式分选Agcg2+的NSC。各组检测用细胞浓度为5×105个/mL。将CellROX? Deep Red reagent（终浓度500～1000 nmol/L）加入样本中，于37 ℃避光孵育30～60 min。在孵育的最后15 min内，每1 mL样本中加1 mmol/L SYTOX Blue Dead Cell Stain solution 1 μL，进行流式分析：于激发光波长405 nm处检测SYTOX Blue Dead Cell Stain，于激发光波长635 nm处检测Cell ROX Deep Red reagent，在450/50 BP和665/40 BP的滤光片处收集荧光发射光。

2.5 qRT-PCR检测核因子E2相关因子2 mRNA表达

采用Trizol试剂提取各实验组细胞总RNA，每组设3个复孔。采用DNaseⅠ（RNA free）去除RNA中残存的DNA，检测提取RNA含量及纯度。RNA纯度测定标准为：A260/A280>2.0。按试剂盒说明书以达到纯度的RNA为模板反转录合成cDNA。反应体系为25 ?L：RNA模板2 ?L，2×Access Quick? Master Mix 12.5 ?L，Nuclease-free water 6.5 ?L，AMV Reverse Transcriptase 0.5 ?L，引物各2 ?L。选择基因β-actin为内参照，进行qRT-PCR检测。Nrf2上游：5'-GACCTAAAGCACAGC-3'，下游：5'-CTCAATCG GCTTGAATGTTTGTC-3'。β-actin上游：5'-CGCGAG AAGATACCCAGAT-3'，下游：5'-GCACTGTGTTGGC GTACAGG-3'，反应条件：95 ℃预变性2 min，35个循环：95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸5 min。基因相对表达量用2-ΔΔCt表示。

2.6 Western blot检测核因子E2相关因子2蛋白表达

收集各实验组细胞进行裂解，按试剂盒操作说明书于低温条件下提取细胞核蛋白，测定蛋白浓度，取50 ?g蛋白质样品进行SDS-PAGE，电泳结束后转至PVDF膜上；室温低速振荡封闭1 h后（封闭液采用5%脱脂奶粉），用TBST（含0.05% Tween-20的TBS缓冲液）温和振荡漂洗3次×15 min；加入兔抗大鼠Nrf2单克隆抗体，稀释倍数为1∶200，4 ℃过夜，TBST洗膜3次后加入二抗（1∶500）室温振荡孵育3 h，读膜采用Odyssey红外荧光扫描成像系统，进行半定量分析处理。

3 统计学方法

采用SSPS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，各组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 肝豆灵药物血清对体外高铜负荷小鼠神经干细胞增殖的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠NSC内Nrf2细胞增殖率明显降低（P<0.01）；与模型组比较，肝豆灵各剂量组小鼠NSC细胞增殖率明显升高（P<0.01）。结果见表1。

4.2 肝豆灵药物血清对体外高铜负荷小鼠神经干细胞内活性氧水平的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠NSC内ROS明显升高（P<0.01）；与模型组比较，肝豆灵各剂量组小鼠NSC内ROS水平明显降低（P<0.01）。结果见表2。

4.3 肝豆灵药物血清对体外高铜负荷小鼠神经干细胞内核因子E2相关因子2表达的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠NSC内Nrf2 mRNA和蛋白表达明显降低（P<0.01）；与模型组比较，肝豆灵各剂量组小鼠NSC内Nrf2 mRNA和蛋白表达明显升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表3。

5 讨论

ROS是细胞发生凋亡的重要因素之一。NSC是一群能够自我更新的细胞，在大脑发育过程中发挥关键作用；它们具有自我扩增和多系分化的特点，能够补偿凋亡或坏死的神经细胞，从而抵抗微环境中的有害变化。研究表明，ROS过度产生可以引起干细胞功能减退，最终导致细胞静止或细胞毒性[2]；另一方面，大量的ROS能够驱动干细胞走出静默状态，逐渐导致干细胞库的耗损[3]。在Wilson病中，多巴胺能神经元对铜毒性更为脆弱，铜和多巴胺形成复合物并能够导致神经细胞凋亡。Nrf2是重要的氧化还原剂，在应激的环境下，Nrf2就会被激活，且与多种抗氧化应激基因结合，进而发挥抗氧化应激的作用。研究表明，Nrf2过表达能促进NSC增殖及向神经元的分化，调控损伤的神经再生过程，并保护NSC不受外来毒素的影响[4]。在许多神经系统疾病研究中发现，Nrf2信号通路均发挥重要作用[5-6]。本课题组前期研究发现，NSC是高铜负荷的一个重要靶点，NSC增殖受损严重影响脑部神经细胞的再生能力，降低ROS导致的损害[7]；并在高铜环境下，机体血液运行受到影响，痰浊、瘀血互相化生，痰瘀互结[8]。临床研究显示，肝豆灵能增加Wilson病患者尿铜和胆汁排铜，对清除肝脏、肾脏、脑部沉积铜有积极作用；可显著改善患者神经系统病变[9]；动物实验研究表明，肝豆灵能够抵抗高铜导致的海马NSC生长阻滞，从而发挥神经保护作用[10]。肝豆灵片处方中石菖蒲、郁金为君药，丹参、姜黄、莪术、鸡血藤为臣药，黄连、生大黄为佐药，诸药合用共奏化痰祛瘀、软坚散结及排铜解毒的作用。现代药理研究显示，石菖蒲、郁金可降低tau蛋白异常磷酸化水平、降低ROS损伤，提升抗氧化应激能力，进而改善痴呆大鼠学习记忆能力[11]；丹参、莪术、姜黄的提取物隐丹参酮、莪术醇、姜黄素对前列腺癌干细胞的增殖有干预作用[12]；大黄、黄连可通过促进Nrf2的活化进而改善肾小管上皮细胞的氧化应激损伤[13]。

课题组前期研究中已建立NSC的高铜负荷模型，并开展了相关实验，最终选用200 μmol/L铜负荷剂量，可导致线粒体跨膜电位降低，但不会对体外培养细胞存活率造成影响[10]。在此基础上，我們制备低、中、高剂量肝豆灵药物血清，研究结果显示，高铜负荷可使小鼠NSC细胞增殖率下降，ROS含量升高，Nrf2 mRNA和蛋白表达下降。不同剂量肝豆灵可通过降低ROS，提高Nrf2的表达，从而促进小鼠NSC的增殖。从该层面阐明肝豆灵治疗Wilson病神经损伤的分子机制，鉴定高铜诱导神经毒性所致的神经病理变化的干预靶点。肝豆灵作用于NSC这个靶点的机制在于干扰了ROS水平；Nrf2作为有效降低NSC中ROS的元件，是肝豆灵作用的有效靶点分子；肝豆灵干扰Nrf2的水平可有效缓解Wilson病，表明上调Wilson病中低表达甚至沉默的Nrf2将为Wilson病的靶向干预提供新的理论和实践依据。在下一步研究中，我们将引入Nrf2-/-神经元干细胞模型，对鉴定出的Nrf2及其下游的分子靶点进行干预，进而验证肝豆灵能否让NSC免受ROS损伤。

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（收稿日期：2018-01-07）

（修回日期：2018-01-29；编辑：华强）