吡虫啉对蜜蜂不同发育期保护酶系活性的影响

（吉林省养蜂科学研究所，吉林 132108）

随着现代化设施农业的发展与进步，蜜蜂等传粉昆虫为农作物授粉增产的作用日益突出。然而，为防止各种农作物的病虫害，人们使用杀虫剂等农药的种类和剂量正逐年递增，不可避免地威胁着蜜蜂等有益昆虫类群的生存安全。

新烟碱类杀虫剂是世界范围内最有效、销量最好的杀虫剂，吡虫啉则是此类杀虫剂的典型代表，是第一个被合成的具有杀虫活性的新烟碱类化合物[1]。吡虫啉自引入市场以来发展迅速，在国内被广泛使用，有研究表明，它对蜜蜂的毒性属于高毒级[2]，会破坏蜜蜂的记忆系统，使采集和学习能力下降[3,4]，影响蜜蜂的运动协调以及寻找和辨别食物的能力[5,6]，影响蜂群幼虫的孵化率、化蛹率和羽化率[7,8]，对蜂王的生殖力和雄蜂的精子形成存在亚致死效应[9]。

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）合称昆虫的保护酶系统[10]，这三者既有功能互补性又有定位互补性，共同构成昆虫有机体相互保护的防御系统[11]，其功能是清除机体内过剩的活性氧，保护机体免受环境胁迫的危害[12]。因此，当蜜蜂处于受到杀虫剂胁迫的逆境条件下，其体内保护酶系统必然会对机体氧化应激做出一定的反应，以适应不良环境。本实验以实验室条件下的蜜蜂工蜂为研究对象，通过考察低剂量吡虫啉对蜜蜂生长发育及各发育时期保护酶系活性的影响，以期揭示蜜蜂保护酶系统在吡虫啉胁迫下的变化规律，为进一步探讨蜜蜂对新烟碱类杀虫剂的抗性机制提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 供试蜜蜂

供试蜜蜂为实验室人工饲育的本地意大利蜜蜂（Apis melliferaL.）。参考刘光楠和曾志将[13]蜜蜂幼虫饲养配方，从1日龄幼虫开始饲喂直至羽化出房，对照组（CK）饲喂基础饲料，处理组1和处理组2进行药物的直接胁迫处理，分别在基础饲料中添加LD10（0.01mg/ml）和LD50（0.1mg/ml）剂量杀虫剂，每日观察生长发育情况并记录幼虫成活率、化蛹率和羽化率。

1.2 试剂与仪器

总超氧化物气化酶（T-SOD）试剂盒，南京建成生物工程研究所；过氧化氢酶(CAT)试剂盒，南京建成生物工程研究所；过氧化物酶(POD)试剂盒，南京建成生物工程研究所。Ultrospec 7000紫外可见分光光度计，英国柏楉有限公司；MGC-H人工气候箱，上海一恒科学仪器有限公司；CO2培养箱，日本三洋公司。

1.3 样品的制备

按照蜜蜂的不同发育时期采集各组样品，分别是幼虫期（5日龄虫）、蛹期（5日龄蛹）和出房期（羽化出房时），收集样品体内的血淋巴液，-80℃保存，备用。

1.4 保护酶系活性测定

严格按照试剂盒的说明操作，计算得出各组样品的SOD酶、CAT酶和POD酶的活力值。测定时每组样品做3个平行处理，取平均数为酶活力值，所有待测样本为同一批次样本。

1.5 数据处理

将获得的实验数据用EXCEL软件进行统计处理，采用数据分析中的单因素方差分析进行差异显著性测定，以P＜0.05作为差异显著性标准。

2 结果与分析

2.1 低剂量吡虫啉对蜜蜂生长发育的影响

吡虫啉胁迫处理后，对蜜蜂幼虫的成活率、化蛹率和羽化率的影响结果见图1。结果表明，随着药物胁迫处理剂量的升高，幼虫成活率、化蛹率和羽化率呈下降趋势。

图1 吡虫啉亚致死剂量对蜜蜂生长发育的影响

2.2 超氧化物歧化酶活性测定

低剂量吡虫啉对蜜蜂各发育时期SOD酶活性的影响见图2，结果可知，对照组（CK）与处理组均呈现先升高再降低的变化趋势，饲喂吡虫啉浓度越高，酶活力值越大，处理组2（LD50）中各发育期的酶活性明显高于处理组1（LD10）和对照组（CK），其中蛹期SOD酶活性最高，其次是出房期和幼虫期，且差异显著（P＜0.05）。

图2 吡虫啉对蜜蜂各发育时期SOD酶活性的影响

2.3 过氧化氢酶活性测定

低剂量吡虫啉对蜜蜂各发育时期CAT酶活性的影响见图3，结果可知，对照组（CK）与处理组均呈现先升高再降低的变化趋势，对照组（CK）与处理组1（LD10）的变化曲线基本一致，处理组2（LD50）中各发育期的酶活性明显高于处理组1（LD10）和对照组（CK），其中蛹期CAT活性最高，明显高于幼虫期和出房期，且差异显著（P＜0.05）。

图3 吡虫啉对蜜蜂各发育时期CAT酶活性的影响

2.4 过氧化物酶活性测定

低剂量吡虫啉对蜜蜂各发育时期POD酶活性的影响见图4，结果可知，对照组（CK）与处理组均呈现先升高再降低的变化趋势，饲喂吡虫啉浓度越高，酶活力值越大，处理组2（LD50）中各发育期的酶活性明显高于处理组1（LD10）和对照组（CK），其中蛹期POD酶活性最高，其次是幼虫期和出房期，且差异显著（P＜0.05）。

图4 吡虫啉对蜜蜂各发育时期POD酶活性的影响

3 讨论

超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、过氧化物酶POD是昆虫体内3种保护性酶系，三者协作调控增强机体的抗逆性，以应对不良环境。对实验中保护酶系的酶活性测定表明，处理组中的SOD酶活性、CAT酶活性和POD酶活性均高于对照组的酶活性，且酶活力值与中毒程度呈正相关，说明吡虫啉的胁迫对蜜蜂体内保护酶系的生成起到激活作用，即机体本身能够提高其保护酶系活性，以适应外源毒素的侵入，降解毒性，减少危害。

低剂量吡虫啉对蜜蜂生长发育的直接影响是出现了延缓滞育现象，我们在饲喂蜜蜂时观察到处理组的化蛹日期与羽化日期较对照组延后1～2日，最多5日，表明吡虫啉胁迫对蜜蜂幼虫的正常发育存在抑制作用。从蜜蜂体内保护酶系活性在不同生长发育时期的变化上看，经吡虫啉处理后体内3种保护酶的酶活力变化均呈现先升高后降低的趋势，在蛹期时达到最大，幼虫期和出房期的保护酶系酶活力因种类不同稍有差异。本实验的研究结果说明，化蛹期是蜜蜂体内保护酶系活性较高、解毒功能较强的阶段，随着日龄的增加，保护酶系活性逐渐降低。

目前国内外关于新烟碱类杀虫剂诱导的蜜蜂氧化损伤方面的研究重点集中在少数几个蜜蜂种类及单一杀虫剂，多在室内暴露的效应关系互作方面，且作用时间短，这与自然状态下复杂的污染状况不同。由于蜜蜂在现实生态环境中往往暴露于多种途径的综合污染[14]，因此怎样有效的与野外实际相结合，研究不同杀虫剂交互作用对保护酶系统协同作用的影响，科学的反应保护酶系对蜜蜂的影响及抗性机理是今后应深入开展的工作。