夏南牛Y-STRs和Y-SNPs多态性及父系起源研究

曾璐岚，史红侠，祁兴磊，林凤鹏，黄永震，蓝贤勇，陈 宏，雷初朝﹡

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.渭南市动物卫生监督所，陕西 渭南 714000；3. 河南省泌阳县畜牧局，河南 泌阳 463700)

夏南牛是以夏洛莱牛为父本，南阳牛为母本，经导入杂交，横交固定，和自群繁育三个阶段的开放式育种培育而成的肉牛新品种[1]。其中南阳牛的血统占到62.5%，而夏洛莱牛血统占37.5%。夏南牛作为我国第一个专门化肉牛培育品种，具有耐粗饲、适应性强、生长发育快、易育肥、产肉率高、肉质好等优点，具有广阔的推广应用前景。

Y 染色体遗传信息是对常染色体、X 染色体及线粒体 DNA 信息重要的补充。哺乳动物的Y染色体遵循父系遗传，单倍型完整，突变率低，不易受重组和回复突变等因素的影响，是研究动物父系遗传多样性、起源和驯化历史的理想工具。近年来，基于Y染色体单核苷酸多态性(Y-SNPs)和微卫星(Y-STRs)的分子遗传研究表明，家牛具有Y1、Y2和Y3三种Y染色体单倍型组，其中Y1和Y2代表普通牛起源，Y3代表瘤牛起源[2]，而这两种分子标记的结合使用能够更准确、精细地反映家牛Y染色体的起源历史[3-8]。

然而，迄今为止，关于夏南牛这一优良的肉用培育品种在分子水平上的遗传多样性、群体遗传结构和父系起源的未见报道。本研究利用2个Y-SNPs标记和2个Y-STRs标记结合分析夏南牛的父系起源、遗传多样性和群体遗传结构，为今后开展该品种的选育策略制定和保种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集与基因组DNA提取

在河南省泌阳县夏南牛科技开发有限公司共采集32头夏南牛公牛耳组织带回实验室，采用基因组DNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取基因组DNA，稀释终浓度至 10～20 ng/μL，-20℃保存备用。

1.2 引物合成和PCR扩增

参照Edwards等[2]、赵晓诚[3]和Li等[7]发表的2个家牛Y-SNPs标记(即UTY-19和ZFY-10)引物信息和家牛2个经典的Y-STR位点，即INRA189和BM861标记的引物信息(详见表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。

表1 家牛Y染色体特异性标记引物信息

25 μL PCR体系：2×Prime STAR Max Premix(上海宝生物公司)10.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，超纯水12.5 μL。

PCR反应程序为：98℃变性10 sec，Ta℃退火15 sec，72℃延伸10 sec，35个循环，后冷却至4℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶(含GoldView核酸染料)电泳后，凝胶成像系统拍照检测。

1.3 测序、单倍型组分型及单倍型多样度计算

将PCR纯化产物送生工生物工程(上海)股份有限公司，用3730XL型DNA测序仪(Applied Biosystems公司)进行正、反向测序，测序结果用Chromas2.3软件进行核实和校正，得到每个夏南牛公牛个体的2个Y-SNP标记的序列多态性及2个Y-STR标记的分型数据，确定不同个体的Y染色体单倍型，最后用Arlequin3.5软件计算群体单倍型多样度 (H±SD)。

2 结果与分析

通过对32头夏南牛2个Y-SNPs标记(即UTY-19和ZFY-10)PCR扩增产物进行测序，发现两个标记都没有检测到多态性，其中UTY-19标记存在C>A核苷酸颠换，而ZFY-10标记存在T>C转换和1个GT核苷酸插入/缺失多态位点(表2)。参照赵晓诚等[3]和常振华等[8]的家牛Y染色体单倍型组的判定标准，结果表明：32头夏南牛全部为Y2单倍型组，所占频率为100%。说明夏南牛只有一种普通牛Y2父系起源。

利用2个家牛Y-STRs标记INRA189和BM861检测夏南牛32头公牛的Y染色体遗传多态性，结果表明，2个标记在32头夏南牛中各检测到1个等位基因，无多态性。在INRA189座位中，夏南牛的等位基因大小为102 bp；在BM861座位中检测到夏南牛的等位基因大小为158 bp(表2)。

结合Y-SNPs和Y-STRs标记结果，参考Edwards[2]和Li[7]的单倍型判定标准(Y-SNP-INRA189-BM861)，在32头夏南牛中确认仅存在1种Y染色体单倍型，即 Y2-102-158，其单倍型多样度为0。

表2 夏南牛Y染色体单倍型频率及多样度

3 讨论

近年来，家牛 Y-SNPs 标记被广泛用于世界牛品种/群体的遗传多样性、群体遗传结构等研究。Y染色体分子标记是追溯家牛起源、驯化历史和迁徙路线的重要工具，可揭示家牛的父系遗传多样性及群体间父系介导的杂交情况。家牛有3种父系起源(即普通牛Y1和Y2单倍型组以及瘤牛Y3单倍型组)，Y-SNPs可以区分这3种单倍型组，而Y-STRs标记可将Y1、Y2和Y3所具有的丰富的单倍型进行精细区分[2-8]。

利用Y-SNPs 标记，对蒙古、日本和韩国 3 个国家的牛品种研究表明[9]，这些国家的牛品种只拥有普通牛 Y 染色体单倍型组，未检测到瘤牛单倍型组。随后，Edwards 等[2]通过分析 138 个欧洲和亚洲牛品种发现，欧洲牛只拥有普通牛 Y 染色体单倍型组。其中 Y1 主要出现在北欧和西北欧，但也出现在多个伊比利亚牛品种和西南亚牛品种中；瘤牛 Y3 单倍型组则主要在亚洲西南部。

而在国内部分黄牛(包括普通牛和瘤牛)品种的父系遗传分析中，常振华等[8]和Li 等[7]对中国 16 个地方黄牛品种进行了父系遗传多样性、群体遗传结构及起源分析，结果一致表明北方黄牛以 Y2 单倍型组为主，南方黄牛以 Y3 单倍型组为主，中原黄牛含普通牛 Y2 和瘤牛Y3 单倍型组。同时，Li 等[7]还发现哈萨克、秦川、吉安 3 个黄牛品种除以 Y2 或 Y3 单倍型组为主外，还含有少量普通牛 Y1 单倍型组个体。

本研究中，我们首次使用 2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)对 32 头夏南牛进行了父系遗传多样性分析，研究显示夏南牛在上述 2 个标记上都无多态性，说明其父系遗传基础稳定、单一。夏南牛的父本为夏洛莱牛，Edwards等[2]研究发现夏洛莱牛属于Y2单倍型组，而根据2个Y-SNPs标记结果显示夏南牛也全部由普通牛Y2 单倍型组构成，即仅有1个父系起源，说明我们的研究结果与夏南牛的培育历史相一致。