笃斯越桔腋芽初代培养技术研究

蔡柯 贾昊 姜茹桐 崔强 马贵义 建德锋

【摘 要】为了缩短笃斯越桔的育苗周期，采用其腋芽进行组培技术育苗，该试验主要针对其初代培养技术进行研究，结果得出：采集笃斯越桔的腋芽，经过消毒后接种到MS+KT 0.6 mg/L培养基上，培养25d，挑选生长健壮的愈伤组织切成0.5cm小块，转入MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L或MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培养基上，可诱导分化出大量不定芽，然后利用这些不定芽作为中间繁殖体材料进行继代。

【关键词】笃斯越桔;愈伤组织诱导;不定芽诱导

笃斯越桔，学名为Vaccinium uliginosum Linn，又被称为笃斯、黑豆树（大兴安岭）、都柿（小兴安岭、伊春）、甸果、蛤塘果（吉林），讷日苏（蒙古族语）等，是杜鹃花科 （Ericaceae） 越桔属 （Vaccinium） 多年生落叶灌木， 一般高度为50～80cm， 果实为蓝紫色小浆果[1]，现被认为是野生藍莓的原种，也称野生蓝莓。该植物一般高0.5～1 m （生于高山的植株一般仅高10～15cm ），多分枝，叶多数，散生，叶片纸质，倒卵形，椭圆形至长圆形，长1～2.8 cm，宽0.6～1.5 cm，顶端圆形，有时微凹，基部宽楔形或楔形，全绿，表面近于无毛，背面微被柔毛，中脉、侧脉和网脉均纤细，在表面平坦，在背面突起，叶柄短，长12 mm，被微毛。花冠绿白色，浆果近球形或椭圆形，直径约1 cm，成熟时蓝紫色，被白粉。花期6月，果期7～8月。主要产于大兴安岭北部（黑龙江、内蒙古）、吉林长白山。笃斯越桔的果实大小与大豆粒相当，酸甜，味佳，可用以酿酒及制果酱，也可制成饮料，是一种集营养、保健、天然于一身的多功能保健水果，蕴含着巨大潜在的经济效益。吉林省长白山余脉实生选种是目前选育果树新品种的有效途径之一，但其为异花授粉果树，实生后代易出现变异，随着离体培养技术的发展，快速、高效、保优的特点，尝试采用组培技术进行笃斯越桔繁育具有重要意义，本试验尝试通过以腋芽作为外植体， 在不同激素组合的培养基上进行诱导，针对初代培养阶段技术进行研究，为其进一步的组培育苗打下基础，以满足市场需求。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2017年12月～2018年3月在吉林农业科技学院花卉组培实验室进行，笃斯越桔外植体采集于小白山（长白山余脉），挑选生长健壮无病害的笃斯越桔植株，从上采取若干带腋芽茎段包装好带回组织培养室备用。

1.2 试验仪器及药品

高压灭菌锅（沈阳科瑞永兴化玻璃仪器有限公司）、电冰箱（美歌电器有限公司）、超净工作台（苏洁净化设备公司）、干燥箱（中国科学院上海光学精密机械研究所）、电子天平（长春长衡电子衡器有限公司）、搅拌仪（苏州奇乐电子科技有限公司）、恒温培养箱（优尼克环境试验设备有限公司）等仪器;MS大量元素、微量元素、铁盐、有机成分所需各种药品，NAA、6-BA、KT等生长激素，84消毒液、升汞、酒精等消毒液。以上仪器及药品均由吉林农业科技学院实验中心提供。

1.3 试验方法

1.3.1 基本培养基及添加成分 初代培养分为两个阶段进行，先形成愈伤组织，再在愈伤组织的基础上诱导不定芽[2-3]。愈伤组织诱导培养基分为4个配比，分别记作：A1：MS+KT1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L;A2：MS+KT1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L;A3：MS+KT0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L;A4：MS+KT0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L。不定芽诱导培养基为5个配比，分别记作：J1：MS+KT0.2 mg/L;J2：MS+KT0.4 mg/L;J3：MS+KT0.6 mg/L;J4：MS+KT0.8 mg/L;J5：MS+KT1.0 mg/L。以上配方均采用固体培养基，添加7 g/L琼脂，30 g/L蔗糖，配方pH调整为5.8～6.0[4-6]。

1.3.2 外植体消毒及接种 将采集回来的带腋芽茎段带到实验室，截成2～3cm长的小段，在准备室内先用流水冲洗20 min，沥干水后放入0.1%升汞溶液中消毒5～8min，倒去消毒液，用蒸馏水冲洗3～4次，然后用0.5%的84消毒液浸泡15min，再次用蒸馏水冲洗干净，沥干水后放入接种室的超净工作台面备用。接种前在超净工作台内再次台内消毒，将腋芽从茎段上切离，切割为0.5cm大小，接种到4种愈伤组织培养基上。

1.3.3 初代培养 外植体接种到愈伤组织诱导培养基上之后，放入培养室进行培养，注意观察每个配方中愈伤组织出现的时间，到接种后第25d时，总体统计各配方愈伤组织形成瓶数，计算愈伤组织诱导率。待愈伤组织长成结构致密、深绿色时，在超净台内切割成0.5cm小块，分别接种到4类芽诱导培养基上，每瓶接种愈伤组织3小块，每种配方接种20瓶，然后再次放入培养室中进行培养，注意观察芽诱导情况，记录形成芽的时间，统计平均形成芽的数量，30 d后计算芽的分化系数。整个初代培养过程中，温度控制在16～25℃，光照度2000～3000 Lx。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导

切割好的腋芽接种到4种不同的愈伤组织诱导培养基上之后，经过统计愈伤组织出现时间及25d后计算愈伤组织诱导率。

由结果可见，4种愈伤组织诱导培养基中均诱导出了愈伤组织，但在愈伤组织出现时间及愈伤组织诱导率方面，各有不同，A4出现愈伤组织的时间最早[7]，A3愈伤组织诱导率最大，说明KT的添加量与愈伤组织的分化相关，添加量多不利于愈伤组织的形成，添加量少有利于愈伤组织的形成。在4个配方中，A3形成的愈伤组织质量最好，愈伤组织诱导阶段的主要目的是形成更多的愈伤组织，综合比较，A3配方比其他配方适合，另保持愈伤组织块致密结实，这样有利于切割后诱导不定芽，因此，4个配方中，笃斯越桔腋芽愈伤组织诱导的最佳配方应该为MS+KT 0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L。

2.2 不定芽诱导分化情况

2.2.1 不同培养基上分化系数 愈伤组织转接到不定芽分化培养基上，均分化形成了不定芽，到转瓶第30d统计每个配方的分化率。5个不定芽分化培养基中，均分化除了不定芽，且5个配方的分化率均大于50%。但在5个配方中的诱导情况存在一定的差异，J2培养基中分化率最高，达到80%，其次为J3、J4、J1、J5相对较低[8]。说明配方中KT植物激素的配比对分化率有一定的影响，KT 0.4 mg/L对愈伤组织不定芽诱导有一定促进作用，较0.8 mg/L诱导效果好，KT的量为0.2 mg/L、0.6 mg/L或者1.0 mg/L，对不定芽诱导的影响不大，三者之间没有较大的差异。就分化率来说，综合比较得出J2分化效果最好。

2.2.2 已分化培养基上分化情况 体现的是分化瓶数多少，但最终形成的不定芽数量及分化速度也对今后的扩繁有较大影响，

观定期察记录差距较大，另分化的速度也不同。可看出，J2、J4形成不定芽的时间比较早，J2形成在转接后的第20 d，J4形成在转接后的第21 d，比J1、J3、J5均早，J1、J3、J5出现在转接后的第26 d及第25 d。从平均分化出不定芽的个数来看，J2（MS+KT0.4 mg/L）配方最多，其次为J4（MS+KT 0.8 mg/L）配方。结合图3-1，可以得出J2、J4配方较优，形成不定芽的时间较早、分化不定芽的数量多。综合得出，在4个不定芽分化培养基配方中，J2（MS+KT0.4 mg/L ）、J4（MS+KT 0.8 mg/L）配方均适合笃斯越桔愈伤组织块进行不定芽的诱导。

3  结论与讨论

通过笃斯越桔腋芽愈伤组织诱导培养，得出MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L配方效果最好，诱导愈伤组织诱导率最高;通过比较不定芽分化情况，得出在添加1.0 mg/L 6-BA的情况下，NAA的量添加到0.2mg/L均为好，结果得出：选用笃斯越桔的带腋芽茎段，经过消毒后，在超净台下将腋芽切割成0.5cm大小，每瓶培养基接种1個腋芽的方式接种到MS+KT0.4  mg/L培养基上，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织切块转入MS+KT0.4 mg/L或MS+KT 0.8mg/L培养基上，分化出多数量的不定芽，然后利用这些不定芽以进一步扩繁。由于时间和精力关系，本试验关于继代、生根阶段的配方及出瓶后的影响等并未探讨，还有待于进一步的研究。

参考文献：

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[3] 顾地周，高捍东，顾美影，等.笃斯越桔离体培养及植株再生

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