HPLC-MS/MS法测定2017-2018年淮安地区小龙虾中硝基呋喃类代谢物残留量

吴 旭，卜媛 媛

（淮安市食品药品检验所，江苏 淮安 223300）

硝基呋喃类抗生素因具有抑菌性和杀菌性，曾广泛用于水产养殖中传染病的预防和治疗[1]。主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因四种，而其对应的代谢产物3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、l-氨基-2-内酰脲(AHD)都能与蛋白质紧密结合，形成稳定的残留物，残留时间达数周以上，甚至在蒸煮、微波加热等情况下仍然无法降解。研究表明硝基呋喃类抗生素及其代谢产物对人体有潜在毒理性危害。欧盟将其列为A类禁用药物[2],且在2005年时又禁止在人类和动物中使用；美国在2002年将其禁用于食源性动物；日本也规定牛肉、猪肉、禽肉、虾肉都不得检出抗生素；我国农业部在2002年颁布禁令禁止将硝基呋喃类药物用在食源性动物身上。

江苏省淮安市盱眙县有着”中国龙虾之都”的美誉,自2001年至今,已举办了18界龙虾节。盱眙境内年产龙虾10万吨，年交易量15万吨，交易额突破60亿元。如今，盱眙80万人中有10万余人在龙虾产业链上淘金，龙虾已经成为盱眙县的支柱产业。

但是一些养殖场高密度饲养、养殖污水不处理等，导致疫病的爆发，为了预防和治疗病害，养殖户违法使用了硝基呋喃类抗生素。本研究通过对淮安地区小龙虾产品中，硝基呋喃类代谢产物的残留量检测，为该地区小龙虾中违禁药物使用情况进行调查，以促进小龙虾产业的健康发展，保障人民的食品安全。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

AOZ、SEM、AMOZ、AHD，农业部环境保护科研检测；D5-AMOZ，13C15N-SEM，13C3-AHD，D4-AOZ，北京曼哈格生物科技有限公司；2-硝基苯甲醛，纯度99%以上，Sigma公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二甲亚砜等均为色谱纯，盐酸、K2HP04、NaOH等均为分析纯；水为Milli-Q制备的超纯水；pH精密试纸(4.5-10.0)。

API4000+超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（沃特世公司），C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，沃特世公司），XS205DU电子天平（METTLER TOLEDO公司）。

1.2 色谱条件

流速：0.2 mL/min；柱温：30℃，进样体积2 μL。流动相：A相0.1%甲酸水溶液；B乙腈,采用梯度洗脱，洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.3 质谱条件

离子源：电喷雾电离源（ESI+）；检测方式：多选择反应监测；CAD：4V；CUR：30 psi；GS1：50 psi；GS2：50 psi；雾化电压：5500 V；离子传输温度：500 ℃。的质谱条件见表2。

表2 质谱条件

2 样 品

2.1 样品来源

淮安地区各农贸市场和水产养殖厂抽样的小龙虾共计83批,覆盖淮安所有地区，采样时间为小龙虾生产季节（5～8月份），每批抽样小龙虾产品随机采集5份样品，每份样品1000 g。

2.2 取样方式

采样组织为虾头、虾壳和虾肉、清洗整虾和未清洗整虾。因小龙虾个体较小，每次用20只小龙虾组织，混合制样。

2.3 样品制备

提取：称取均匀试样（2g）于50 mL棕色具塞离心管中，加入10mL甲醇-水混合液（2+1），均质1 min，再用5 mL甲醇-水洗涤均质器刀头，二者合并4000 r/min离心5 min，吸取上清液弃掉。向每个样品管中加入混合内标溶液，使最终测定浓度均为2.0 ng/mL。

水解和衍生：向上述每个离心管中加入10 mL0.2 mol/L盐酸溶液均质1min，用10mL 0.2mol/L盐酸溶液洗涤均质器刀头，二者合并后加入0.3 mL0.0 5mol/L2-硝基苯甲醛溶液，用液体混匀器混匀，置恒温水浴振荡器中37℃避光振荡16 h。

净化:取出离心管冷却至室温，加人5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.4，4000 r/min离心10min，上清液倒入下接Oasis HLB柱的贮液器中，使样液以＜2 mL/min的流速通过Oasis HLB柱，待样液全部通过Oasis HLB柱后用10 mL水洗涤Oasis HLB柱，弃去流出液。用真空泵在65 kPa负压下抽干Oasis HLB柱15 min。用5 mL乙酸乙酯洗脱被测物于25 mL棕色离心管中，用氮吹仪在40℃水浴中吹干，用样品定容溶液溶解并定容至1.0 mL，过0.2 μm滤膜用液相色谱-串联质谱测定。同时做空白试验。

3 结果与讨论

3.1 结果比较

2017年淮安地区小龙虾产品40批，2018年43批，共计83批，结果见表3。在这两年中呋喃西林仍然存在违规用药情况，2017年检出率62%，2018年检出率63%，而呋喃唑酮、呋喃它酮和呋喃妥因均未有检出。

表3 2017～2018年淮安地区小龙虾产品中硝基呋喃类代谢物残留量检测结果

本方法中AOZ、AMOZ、SEM、AHD的检出限均为0.50µg/kg，四种代谢物加标回收率70%～106%，相对标准偏差RSD≤10%，符合国内外相关规定要求。

3.2 SEM问题

在检测中，很多样品都检测出了阳性的SEM，空白时SEM的检出率在10%以下，浓度在0.21µg/kg左右。

将小龙虾的虾头、虾壳和虾肉分别检验，发现在虾壳中SEM的含量最高，虾肉中SEM含量只是整虾的1/10，见图1。可见SEM检测结果和取样的组织部位有很大关系。

图1 小龙虾各部分中SEM含量

将同一批虾清洗和未清洗分别检验，发现未清洗的SEM含量是清洗过后的1.1倍，可见在养殖的水体[3]和池塘的底泥[4]中可能也含有呋喃西林，见表2。

表2 清洗与为清洗的小龙虾全虾中SEM的含量

4 结 论

本文采用HPLC-MS/MS法测定2017-2018年淮安地区小龙虾中硝基呋喃类代谢物的残留量。结果发现除了SEM外，其他代谢物都没有检出，说明四种硝基呋喃类药物中，之前在水产养殖中常用的呋喃唑酮已得到有效控制，但是呋喃西林的使用有增无减。而样品的取样部位对SEM的结果影响很大，处理样品时务必混合均匀，同步做好空白实验进行比较。同时也要注意SEM的假阳性问题，对于SEM是不是由小龙虾虾壳中自身产生，还有待进一步研究，所以SEM的定性也是检测的一大难点。简单的从SEM的测定结果上就判断使用了呋喃西林违禁药品，也有失公允。