水质安全性评价方法中阳性参照物的筛选及预测无效应浓度值的确定

李启元， 马晓妍， 王晓昌， 王永坤

(西安建筑科技大学 环境与市政工程学院，国家城市非传统水资源开发利用国际科技合作基地， 西北水资源与环境生态教育部重点实验室，陕西省污水处理与资源化工程技术研究中心，陕西 西安 710055)

1 研究背景

生态毒性检测作为反映水体污染程度和评价水处理技术有效性的重要方法，能够通过生物指标更直观、全面地反映水体中的污染物对水生态环境中的水生生物的不利影响。生态毒性检测主要采用水生生物作为受试体，体现的是综合的生态毒性效应。传统的生态毒性检测按照受试生物营养级的不同可分为细菌类(发光细菌、硝化细菌等)、藻类(普通小球藻、羊角月牙藻、斜生栅藻等)、蚤类(大型蚤、剑水蚤等)、鱼类(斑马鱼、青鳉鱼等)等毒性检测[1-2]。

基于生态毒性试验的水质评价方法有很多，主要包括潜在毒性法、毒性单位分级评价法、潜在生态毒性效应指数法和水质安全分级法等[3-4]。其中，基于成组生态毒性检测的水质安全分级方法是Wei 等[5]在2006年建立的更为全面、可靠的评价体系，弥补了其它方法的不足[6]。它是选择处于不同营养级的3种敏感物种进行毒性测试，提出3种毒性的得分标准，并据此进行水质分级。将水样的毒性测试结果转化为毒性得分，以3种毒性测试中最差的毒性得分作为水样的最终得分，以获得该水样的水质安全等级[7]。该方法中最重要一步是选择合适的阳性参照物并确定其预测无效应浓度(PNEC)，据此建立毒性得分标准。

SSD方法可获得不同物种对某一胁迫因素敏感度，可用于分析化合物引起的生态风险[8]。最早由 Kooijman (1987)[9]提出，该方法因其简明、生态意义明确等优点，在国外被广泛应用。相较而言，国内在SSD的研究方面较少。乔敏(2007)等[10]首次使用SSD方法分析多环芳香烃的生态风险。因为该方法可将所有的生物都纳入考察范围，在分析化合物对生物的胁迫方面更为全面，近年来亦被广泛应用于化合物PNEC值的估计[11-12]。

通过查阅文献、资料及国内外标准，发光细菌毒性检测的阳性参照物常选择苯酚和硫酸锌[13]；微藻生长抑制试验常选择重铬酸钾[14]和氯化铜[15-16]；水蚤抑制运动试验常选择重铬酸钾[17]和五氯酚[18]；鱼类致死试验常选择3,4二氯苯胺和氯化汞[18]。本文利用物种敏感性分布(SSD)方法拟合并计算出这几种化合物对这4个营养级物种的PNEC值，比较4个物种对其对应两种阳性参照物的敏感度，选择出最适合这4个毒性试验的阳性参照物，为研究者在利用成组生态毒性检测的水质安全分级评价中毒性得分标准的制定提供依据。

2 数据与方法

2.1 毒性数据获得与筛选

SSD的基本假设即物种敏感性能够被某分布所描述，而获得的毒理数据来自这个分布，因此可用所查阅到的毒理数据估算这个分布的参数[19]。毒性数据主要来自国内外发表的文献以及USEPA ECOTOX 数据库(http://cfpub.epa.gov/ecotox/)。根据该数据库提供的数据分类确定以下标准：(1) 毒性终点：除藻类选择半最大效应浓度(EC50)作为毒性终点外，其它物种选择半数致死浓度(LC50)作为毒性终点；(2) 暴露介质：介质选择淡水；(3) 试验环境：选择实验室环境；(4) 暴露时间的选择：为保证所有参与拟合的数据都有较高的一致性，选择暴露时间为2～4 d。由于苯酚和3，4二氯苯胺关于藻类的毒性数据过少，因此将苯酚和3，4二氯苯胺关于藻类毒性数据的暴露时间放宽到1～5 d。

2.2 物种分类与数据处理

经从数据库查询，筛选并剔除异常值后，苯酚共得543个毒性数据，硫酸锌883个，氯化铜602个，重铬酸钾497个，五氯酚657个，3,4二氯苯胺110个，氯化汞481个。对各数据进行分组合并，同一物种具有多个数据来源的取其算术平均数[4]。为了分别分析化合物对不同营养级生物的胁迫能力，将全部物种细分为藻类、两栖类、鱼类、甲壳类、昆虫和蜘蛛类、蠕虫类、软体类、其它无脊椎类[20]，并将水蚤从甲壳类中分离出来单独分析。经过物种分组后7种化合物对应各物种的毒性数据量如表1所示。

考虑到在样本估算整体这一过程中太少样本量带来的误差问题， OECD 及澳大利亚水质标准推荐的最小数据量为5个[21]，还有一些政府指导性文件推荐值为8～10个[22]。本文将着重分析的藻类、鱼类、蚤类的拟合数据的最小数量选为5个，其它物种拟合数据的最小数量选为10个，毒性数据小于10个的不进行拟合分析。

表1 筛选的7种化合物对应各物种的毒理数据个数

2.3 SSD曲线拟合

应用Burrlioz 2.0软件，采用澳大利亚及新西兰的环境风险评价和环境质量标准中均被推荐的BurrⅢ 模型对SSD曲线进行拟合[21]。BurrⅢ 型函数如公式(1)所示，其它变形如公式(2)和公式(3)所示。

(1)

式中：x为污染物的质量浓度，μg/L；b、c、k分别为函数的尺度、位置、形状参数。

当c趋于无穷大时，BurrIII分布可变化为RePareto分布：

(2)

当k趋于无穷大时，BurrIII 分布可变化为ReWeibull 分布：

(3)

实际应用中，k值>100 时，即可应用ReWeibull分布函数进行拟合；c值>80 时，采用RePareto 分布进行拟合。

2.4 PNEC值以及PAF的计算

在拟合曲线上对应于5%积累概率的浓度称为HC5，亦或者称为95%保护浓度，即当污染物环境浓度小于该值时，95%的生物都不会受到影响。以HC5值作为化合物的PNEC值[16,23]。可能受物种影响的比例，即PAF值，表示环境浓度超过生物毒理终点值的物种比例，即给定的污染物浓度在SSD曲线上对应的累积概率，其计算公式等同BurrⅢ型函数，即公式(4):

(4)

3 结果分析

3.1 SSD曲线拟合结果

根据物种毒性数据参与拟合的最小数量，将表1中7种化合物所有适合拟合的各物种的毒性数据导入软件进行曲线拟合，并计算出各曲线的参数。如表2所示。

由表2可知，BurrⅢ 型方程的3种形式在以上物种对7种化合物的SSD曲线均有体现，其中大多数SSD曲线为BurrⅢ 型或ReWeibull型，RePareto型曲线最少。苯酚的全物种和6个分物种的SSD曲线都适用于ReWeibull型。其它6个化合物的全物种和分物种则主要采用BurrⅢ 型和ReWeibull型两种拟合模型。只有水蚤对硫酸锌的SSD曲线和软体类物种对重铬酸钾的SSD曲线采用RePareto模型拟合。

3.2 化合物的PNEC值

7种阳性参照物的PNEC值及其置信区间如表3所示。由表3可以看出，7种化合物对全部物种的PNEC值大小顺序为：苯酚>3,4二氯苯胺>硫酸锌>五氯酚>重铬酸钾>氯化铜>氯化汞。苯酚对全部物种的PNEC值最大，达到5.86×103μg/L，而氯化汞的PNEC值最小，仅有7.30 μg/L。

对苯酚而言，鱼类相较之敏感度最高(PNEC值为4.46×103μg/L)，蠕虫和软体对苯酚则敏感度较低；对硫酸锌而言，藻类敏感度最高(PNEC值为27.0 μg/L)，昆虫/蜘蛛类敏感度最低；氯化铜的PNEC值为11.0 μg/L，这一数值与吴丰昌等[15]通过毒性百分数排序法推导出短期质量浓度值(9.10 μg/L)以及渔业标准值(10.0 μg/L)十分接近；各类物种对于氯化汞的PNEC值都很低，全部物种的PNEC值为7.30 μg/L，这一数值与李会仙等[24]的研究结果相近。对重铬酸钾而言，甲壳类灵敏度最高(PNEC值为4.00 μg/L)，鱼类敏感度最低，达1.32×104μg/L，两者相差三个数量级，即鱼类对重铬酸钾耐受性很强。对五氯酚而言，全部物种PNEC值为39.0 μg/L，大于雷炳莉等[25]的估算值。鱼类的灵敏度最高(PNEC值为29.0 μg/L)，昆虫类灵敏度最低(PNEC值为490 μg/L)。由于3，4二氯苯胺的毒性数据有限，可进行SSD曲线分析的只有藻类和鱼类，藻类对3，4二氯苯胺的灵敏度要高于鱼类。

3.3 阳性参照物的选择

生态毒性检测中阳性参照物的选择首先应保证其致毒机理明确；其次是该生物对阳性参照物的响应灵敏，并具有良好的剂量-效应关系；再次是阳性参照物应是较为常见的化合物，以方便研究者使用。为获得较为灵敏的阳性参照物，本研究选择通过全物种SSD方法分析各类化合物的物种敏感度，并考虑待测样品的性质进行综合分析，确定生态毒性检测中的阳性参照物。

比较发光细菌毒性试验中常采用的阳性参照物苯酚和硫酸锌，全物种对苯酚和硫酸锌的敏感度存在明显差异，见图1(a)。硫酸锌对全物种的PNEC值更小，仅为114 μg/L。对于苯酚的SSD拟合曲线，在质量浓度小于2.80×103μg/L时，对全物种几乎没有影响，随着质量浓度的升高，其PAF才随着浓度增加而上升。在此后很大一个浓度范围内，两条曲线坡度相近，说明在此区间内，随着这两种化合物浓度的变化可影响的物种数量相当。在综合PNEC值及全部物种对苯酚和硫酸锌的敏感度后，选择硫酸锌作为发光细菌毒性检测的阳性参照物。

表2 7种化合物对各物种的SSD曲线模型及参数

表3 7种化合物对各物种的PNEC值及95%置信区间

对微藻生长抑制试验中常用的两种阳性参照物氯化铜和重铬酸钾而言，氯化铜的PNEC值(11.0 μg/L)略小于重铬酸钾的PNEC值(16.0 μg/L)，浓度很低时全部物种对重铬酸钾的敏感度更高，见图1(b)所示。不过，当质量浓度大于9.90 μg/L时，氯化铜的SSD曲线坡度较重铬酸钾的更大，即高浓度时，全部物种对氯化汞的敏感度更高。综合考虑，选择氯化铜作为微藻生长抑制试验中的阳性参照物。

水蚤抑制运动试验的阳性参照物常选取重铬酸钾和五氯酚，二者的PNEC值分别为16.0和39.0 μg/L。总体来看(图1(c))，生物对重铬酸钾的响应更为灵敏，并且重铬酸钾的初始响应质量浓度更低。不过重铬酸钾的SSD曲线相较于五氯酚的坡度更缓，即在高质量浓度时，生物对五氯酚更为敏感。因此，选择重铬酸钾作为水蚤抑制运动试验的阳性参照物。

鱼类致死试验常采用的两种阳性参照物为3,4二氯苯胺和氯化汞，其SSD拟合曲线如图1(d)所示。3,4二氯苯胺和氯化汞的PNEC值分别为361和7.30 μg/L。总体来看，生物对氯化汞的响应更为灵敏。然而，氯化汞的SSD曲线坡度比3,4二氯苯胺的更缓，即在高质量浓度段，全部物种对3,4二氯苯胺更敏感。综合比较后，选择氯化汞作为鱼类的阳性参照物。

3.4 受试物种对阳性参照物的敏感度分析

由于水环境样品的毒性试验多采用水生生物作为受试生物，因此，阳性参照物对该物种的敏感度分析将有利于研究者更深刻理解获得的毒性数据。因此，本文着重讨论藻类对氯化铜和重铬酸钾的SSD曲线，水蚤对重铬酸钾和五氯酚的SSD曲线，以及鱼类对3,4二氯苯胺和氯化汞的SSD曲线。由于发光细菌并不属于常规的生物分类方法，并且缺乏化合物对各种发光细菌的毒性数据，尚无法分析发光细菌对苯酚和硫酸锌的SSD曲线。

重铬酸钾和氯化铜对藻类的PNEC值分别为22.0和163 μg/L，其SSD拟合曲线如图2(a)所示。即在中低质量浓度藻类对重铬酸钾更灵敏。藻类对重铬酸钾的初始响应质量浓度较低，当浓度大于458 μg/L时，藻类对氯化铜的敏感度比重铬酸钾要高。从全物种和藻类两个角度考虑，氯化铜的敏感度均比较高。

重铬酸钾和五氯酚对水蚤的PNEC值分别为1.70和96.0 μg/L，其SSD拟合曲线如图2(b)所示。水蚤对重铬酸钾更为灵敏。从全物种和水蚤两个角度考虑，重铬酸钾的敏感度都是最高的。

氯化汞和3,4二氯苯胺对鱼类的PNEC值分别为48.0 μg/L和1.89×103μg/L，其SSD拟合曲线如图2(c)所示。鱼类对氯化汞更为灵敏。由图2可看到鱼类对氯化汞的SSD曲线坡度明显小于3,4二氯苯胺，即低质量浓度时，鱼类对氯化汞更敏感，但在高浓度时，则对3,4二氯苯胺更为敏感。从全物种和鱼类两个角度考虑，氯化汞的敏感度都是最高的。有研究表明，相同浓度下，重金属化合物对生物的毒性比有机物要高[26]。这与本研究的结果相符。此外，在选择阳性参照物时也应考虑待测样品的性质进行阳性参照物的选择，当水样中以重金属为主要污染物时，可选用氯化汞作为阳性参照物；有机污染的水样则可采用3,4二氯苯胺作为阳性参照物。

注：图中C的单位为μg/L。

注：图中C的单位为μg/L

4 结 论

(1)通过对常用于生态毒性检测的7种阳性参照物的水生生物毒性数据的搜集、筛选及最终拟合，可知七类阳性参照物对于全物种和分物种的SSD曲线主要为BurrⅢ型和ReWeibull型，RePareto型曲线最少。基于全物种分析，7种化合物的PNEC值大小顺序为：苯酚>3,4二氯苯胺>硫酸锌>五氯酚>重铬酸钾>氯化铜>氯化汞。

(2)通过全物种SSD曲线分析和每种水生生物毒性检测所采用的生物种群分析，确定发光细菌毒性试验、微藻生长抑制试验、水蚤抑制运动试验及鱼类致死试验的最优阳性参照物分别为：硫酸锌、氯化铜、重铬酸钾、氯化汞，其PNEC值分别为114.0、11.0、16.0、7.30 μg/L。

(3)比较重铬酸钾和氯化铜对藻类的SSD曲线，在低浓度时藻类对重铬酸钾较为敏感，高浓度时藻类对氯化铜的敏感度较高。对于重铬酸钾和五氯酚对水蚤的SSD曲线，水蚤对重铬酸钾始终最为灵敏。比较氯化汞和3,4二氯苯胺对鱼类的SSD曲线，在低质量浓度时，鱼类对氯化汞更敏感，但是高浓度时，鱼类对3,4二氯苯胺较为敏感。

(4)生态毒性检测中阳性参照物的选择仍需考虑水质本身的特性，如待测定评价水中有机物较多，则优先选择有机物作为阳性参照物。