痰结核分枝杆菌DNA检测诊断肺结核的临床意义

冯彦军，李小红，凌 寅，王霞芳，叶志坚，吴妹英

肺结核是发生在肺组织、气管、支气管和胸膜的结核病变[1]。2016年WHO的结核病报告显示：全世界2015年新发结核病患者超过1000万，而中国大陆新发肺结核人数（93万）居全球第3位，仅次于印度和印度尼西亚[2]。肺结核患者的早发现、早隔离、早治疗可以有效防止肺结核传播，但由于肺结核临床表现及胸部影像学表现复杂多变、涂片阳性率低、结核分枝杆菌培养时间长等原因，寻找快速、有效的肺结核确诊方法仍是目前一个重要的问题。结核分枝杆菌DNA检测（晶芯分枝杆菌核酸检测），采用双重实时荧光PCR技术结合Taqman探针技术检测分枝杆菌的核酸，能在3 h内完成检测，实现快速诊断。本文回顾分析了136例肺结核患者痰结核分枝杆菌DNA检测的结果，对该项检验技术在肺结核诊断中的价值进行总结，报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2016年5月—12月在苏州大学附属传染病医院结核病科住院患者，经改良罗氏结核培养法确诊为肺结核的患者136例（痰结核分枝杆菌培养阳性为确诊标准）。其中男86例，女50例，年龄为14～70岁，平均为37岁。

1.2 方法

1.2.1 标本收集方法 将所有受检对象清晨漱口后咳出的深部痰液分别装入一次性痰瓶中，加盖送检，痰液标本应避免唾液混入。

1.2.2 所有受检对象均行痰涂片找抗酸杆菌，并进行痰结核分枝杆菌DNA检测及痰结核分枝杆菌培养。具体检测方法如下。

1.2.2.1 抗酸染色检测 ①取标本（痰液浓厚部分）进行涂片；②在火焰上加热固定；③加石碳酸复红溶液，再次加热至蒸汽出现，约5 min后用水洗，加入脱色剂，轻摇玻片至无红色脱落，再次水洗，加入复染液，再次染色约1 min；④晾干玻片，最后放置在显微镜油镜下进行观察。

1.2.2.2 结核分枝杆菌DNA检测 ①将10%NaOH和痰液等体积混合，在振荡器上振荡混匀约2 min，常温下静置30 min；②12 000 rpm离心2 min，弃上清；③加入1 ml洗液，振荡混匀，12 000 rpm离心2 min，弃上清；④用移液器将剩余液体吸干，注意不要碰到沉淀；⑤加入50 μl核酸提取液，混匀，转移到核酸提取管；⑥置于核酸提取仪中，以最大转速振荡5 min，置于95 ℃水浴锅中加热5 min；⑦瞬时离心，上清用于核酸检测。通过2个通道的扩增情况对检测结果进行判读（表1）。

表1 分枝杆菌DNA检测结果判定Table 1 Determination of Mycobacterium DNA test results

1.2.2.3 结核分枝杆菌培养及药物敏感试验 ①将收集的患者痰标本按常规方法处理后置于BACTEC MGIT-960结核杆菌培养仪中培养。②将培养获得的结核分枝杆菌进行药物敏感（药敏）试验（比例法）：将待测菌液制成10-2g/L和10-4g/L的细菌液，用标准接种环（22SWG）分别蘸取1环（即0.01 ml）的细菌液，用划线法均匀接种至培养基表面（对照及含药分别接种），最终的接种量为10-4mg和10-6mg。③接种后将培养基置于37 ℃培养箱中，4周后读取菌落数并计算耐药百分比，＞1%为耐药，≤1%为敏感。

1.3 仪器与试剂 生物显微镜CX41（三目）购自日本奥林巴斯公司。分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）购自博奥生物有限公司，国食药监械（准）字2014第3401215号。BACTEC MGIT-960结核培养仪购自BD生物科学。

1.4 统计学处理 应用CHISS 2004统计软件对结核分枝杆菌DNA检测和痰涂片找抗酸杆菌2种方法进行相关性分析和检出率差异性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2种检验方法的灵敏度 136例痰结核培养确诊的肺结核患者中，痰涂片找抗酸杆菌的灵敏度为47.06%（64/136），痰结核分枝杆菌DNA检测的灵敏度为64.71%（88/136），高于痰涂片找抗酸杆菌。

2.2 2种检验方法的相关性和差异性 136例肺结核患者中，痰涂片找抗酸杆菌阳性64例，痰结核分枝杆菌DNA检测阳性88例。痰涂片找抗酸杆菌阴性的72例患者中痰结核分枝杆菌DNA检测阳性29例，占40.28%。2种检验方法相关性检验用四格表χ2检验，χ2=39.978，P=0.000，说明2种方法具有相关性。2种检验方法检出率差异性检验用配对四格表χ2检验校正公式，校正χ2=15.559，P=0.000，结核分枝杆菌DNA检测阳性率（64.71%，88/136）大于痰涂片找抗酸杆菌法（47.06%，64/136）。见表2。

表2 痰结核分枝杆菌DNA检测与痰涂片找抗酸杆菌结果比较（例）Table 2 Comparison of detection results of sputum Mycobacterium tuberculosis DNA test and sputum smear looking for Acidfast bacillus (cases)

3 讨 论

肺结核是一种具有漫长历史的慢性传染性疾病，目前有死灰复燃的趋势，严重危害人类健康，全球有22个肺结核高负担国家，我国是其中一个，同时我国也是全世界27个耐多药结核流行的高负担国家之一[3]。控制和管理肺结核的最大障碍是缺乏快速、准确和具有成本效益的检测方法[4]。肺结核以病原学检查为确诊的主要依据，目前肺结核的诊断依赖于传统的结核分枝杆菌抗酸染色涂片和结核分枝杆菌培养[5]，但这2种方法都不能满足临床需求。痰涂片找抗酸杆菌虽然简便、快速、易行，但敏感性差，阳性率低，只有13.85%～22.90%[6-7]，且容易出现假阴性，通常每毫升痰液有5000～10 000条杆菌时才能检出。且涂片阳性只表明有抗酸杆菌，是否为结核分枝杆菌还须进一步确认。分枝杆菌的培养是结核分枝杆菌检测和药敏试验诊断的金标准[8]，缺点是耗时长。传统的固态培养法，需要4～6周才能检测到结核分枝杆菌的生长，而且阳性率只有30%～40%，特异度差，各种分枝杆菌均可生长，要确定是否为结核分枝杆菌，须结合分枝杆菌菌种鉴定和药敏试验[9]。液体培养目前主要有罗氏改良培养法，培养周期约5周，显然满足不了临床快速诊断的需求。因此，探索早期、快速、准确诊断肺结核的方法成为当前结核病研究的重点[10]。

而随着分子生物学迅速发展，利用核酸检测技术检测结核分枝杆菌逐步应用于肺结核的诊断。核酸检测是对结核分枝杆菌特异的DNA或RNA核酸序列进行检测，结果阳性提示标本有结核分枝杆菌存在，在排除标本核酸污染的前提下可确认存在结核分枝杆菌。目前核酸检测针对结核分枝杆菌的靶序列较常用的有插入序列6110、MBP64基因、rpoB、热激蛋白65等，主要采用的检测技术包括传统实时荧光定量PCR技术、环介导等温扩增技术、半巢氏全自动实时荧光定量PCR技术、实时荧光核酸恒温扩增技术、基因探针检测和交叉引物恒温扩增技术等。其中最具代表性的是Xpert技术，该技术可在2 h内检测痰液标本是否存在结核分枝杆菌，并能检测利福平的耐药性，已被WHO推荐为疑似结核分枝杆菌感染检测的初筛方法[11]，但该法检测步骤较为繁琐，仪器与试剂价格昂贵，在一般实验室难以开展。

结核分枝杆菌DNA检测，采用双重实时荧光PCR技术结合Taqman探针技术检测分枝杆菌核酸，能在3 h内完成检测，实现快速诊断，是目前国内获得国家食品药品监督管理总局认证的可以快速检测结核分枝杆菌核酸的PCR产品。本研究回顾性分析136例痰结核分枝杆菌培养确诊肺结核患者的临床资料，痰涂片找抗酸杆菌阳性64例（47.06%），痰结核分枝杆菌DNA检测阳性88例（64.71%）。痰结核分枝杆菌DNA检测阳性率明显高于痰涂片，差异具有统计学意义。在痰涂片找抗酸杆菌阴性的72例患者中痰结核分枝杆菌DNA检测阳性29例，占痰涂片阴性肺结核患者比例的40.28%。说明痰结核分枝杆菌DNA检测能提高涂阴肺结核的诊断水平，对涂阴肺结核的诊断具有重要意义。本研究中发现有5例肺结核患者，痰涂片找抗酸杆菌阳性，但结核分枝杆菌DNA检测阴性，考虑可能与痰液标本采集不严格、试剂、实验操作因素等有关，提示要严格把控痰结核分枝杆菌DNA检测过程，以提高痰结核分枝杆菌DNA检测对肺结核病诊断的准确性。为了说明痰结核分枝杆菌DNA检测对肺结核诊断的意义，本研究仅选择了诊断明确的结核分枝杆菌培养阳性的患者作为观察对象，没有纳入阴性的疑似患者，无法计算该诊断方法的特异度，但目前已有临床报道该方法特异度为98.9%（271/274）[12]，特异度比较高。

在临床工作中，遇到痰涂片找抗酸杆菌检查结果未出或阴性，但结核中毒症状明显，反复高热，结核分枝杆菌DNA检测阳性的患者，结合患者胸部影像学改变及其他辅助检查提前诊断性抗结核治疗，患者发热症状得到良好的控制，因此早期的结核分枝杆菌DNA检测对临床诊治有重要参考意义。

4 结 论

痰结核分枝杆菌DNA检测是一种快速、敏感的病原学诊断方法，优于常规的痰涂片找抗酸杆菌方法，能够辅助涂阳肺结核的诊断，并提高涂阴肺结核的诊断水平，为涂阴肺结核的临床诊断提供重要依据，对肺结核的防治具有重要意义，临床应用有良好前景。