抗疟先导物MMV007978对拟南芥的结构-活性关系

宣 静 编译

(上海市农药研究所，上海 200032)

杂草与栽培植物竞争资源，大大地降低了作物的生产率，持续威胁着农业生产。现代农业主要以除草剂防治杂草，显著增加作物产量。然而杂草对除草剂产生抗性，在许多情况下对多种作用机制的除草剂发展了抗性，使得杂草的防除成为重大挑战，特别是在几十年来没有新作用机制除草剂上市的情况下。在1957-2016年共有479个抗性杂草案例被报道，同时对2种或2种以上除草剂产生抗性的杂草数量极大的增加(www.weedscience.org)。据估全球70亿人口每年仍在不断增加，预期在2050年达到92亿，需求的食物将增加70%。气候的变化对全球的影响和不断增长的人口对可耕地竞争将都会对粮食生产造成挑战。

与疟疾有关的寄生性疟原虫和植物有共同的进化关系。它们过去进化特点为疟原虫和其他顶复合器门寄生虫体内保留了退化的、类植物非光合质体的质体样细胞器，定名为apicoplast。有趣的是，植物和疟原虫间的这种关系进一步得到了可作为抗疟疾化合物的商业化除草剂的强调，这表明这两个生物具有相似的生物靶标。最近，笔者研究表明许多抗疟疾药以模式植物拟南芥为防治对象试验时为有效除草活性化合物。

Medicines for Malaria Venture(MMV)提供了丰富的抗疟疾先导化合物资源，想法设法促进经济有效抗疟疾药物的研究和开发(www.mmv.org)。此组织提供了类药性和类探针化合物(probe-like compound)库，被名命为“Malaria Box”，其中的化合物对红内期恶性疟原虫(P. falciparum)有活性。这些化合物是简单的、结构多样分子，缺少一般毒性，具有好的理化特性。以前笔者研究表明Malaria Box中的一些先导化合物也具有除草活性，其中MMV006188在土壤和温室研究中有活性，是除草活性和新作用机制开发的新化学骨架。因此，笔者对Malaria Box中其他物质进行了开发，评估其除草活性。如果得到有用的苗头化合物(hit)，这些物质会被进行一系列的结构修饰；化合物也用于生理试验以研究作用机制。

1 材料和方法

1.1 用琼脂板预选有除草活性的MMV化合物

用70%乙醇对拟南芥生态型Col-0种子表面消毒3 min，然后用100% 乙醇消毒1 min，浸入无菌水中3 min。消毒后把种子再悬浮于0.1%无菌琼脂中，置于黑暗、4℃条件下3 d，打破种子的休眠，同时发芽。在冷的条件下种子层积催芽后，种植于96孔板中，每孔中有250 μL培养基[1%葡萄糖、2%琼脂、0.45% Murashige & Skoog盐和维生素、0.3% 2-(N-吗啉基)-乙磺酸(MES)(体积比)，pH 5.7]、适宜浓度除草剂、MMV化合物(都溶解于二甲亚砜，DMSO)。所有化合物的测试浓度80 μM。为了避免污染，用有孔胶带密封96孔板。在16 h光/8 h暗，60%相对湿度(RH)，22 ℃培养室种子发芽一周，然后拍照。以肉眼评估化合物的除草活性。

1.2 化合物处理种植于土壤中的拟南芥

把约30颗拟南芥Col-0种子种植于装有育苗基质和爱尔兰泥炭(Bord na Mona Horticulture Ltd,Newbridge，Ireland)的盆(63×63×59 mm)中。在种植前预湿土壤到饱和，在试验过程中浇水保持充足的湿度。土壤中不添加肥料。在无光、4 ℃条件下冷处理种子3 d，发芽，然后在16 h光/8 h暗，60%相对湿度(RH)，22 ℃培养室培养。把商业化除草剂和类似物化合物溶解于DMSO，配制成20 mg/mL溶液，在处理前用水稀释。在最终浓度为200 μL/L的溶液中加表面活性剂 Brushwet (SST Dandenong,Australia)。以下商业化除草剂活性成分为阳性对照：氟乐灵、氨磺乐灵、麦草畏和烯草酮；溶剂DMSO为阴性对照，因为DMSO被用于制备所有储备溶液。用吸液管分别吸取每个化合物的500μL 0、25、50、100、200或400 mg/L处理溶液处理种子(芽前)或种苗(芽后)；以上用量分别对应于剂量约有效成分35、70、140、280和560 g/hm2。盆中土壤(干燥土壤)密度约为0.29 g/cm3，芽前处理土壤中除草剂溶液的量为10 μL/g土壤，芽后处理为20 μL/g，因为在芽前施用一次(0.5 mL)，芽后施用2次(1.0 mL)。托盘移入培养室的第1 d被作为0 d，这个时间只进行芽前处理。在第3 d和第6 d芽后处理2次，一直培养16 d，然后拍照。用肉眼首先评估每个化合物的除草活性，对有很好除草活性的化合物，用3个浓度重复3次进行试验。用绿叶表面积法确定生长抑制活性。

1.3 MMV007978衍生物

所有 MMV007978衍生物从商业卖主购买(Ambinter，Orleans; France 或 AKos，Steinen,德国)，溶解于DMSO配制成20 mg/mL溶液，用于盆栽试验或温室和生理研究。

1.4 温室研究

温室研究在德国标准温室中进行。培养容器为塑料花盆，装有含有3%的腐殖质的壤砂土。对于芽后处理，不同的试验植物首先分别育苗，在处理前几天把苗移栽到试验容器中。对于禾本科植物，每盆种 10～20株，但对于较大的阔叶品种[反枝苋(Amaranthus retroflexus)、苘麻(Abutilon theophrasti)]，每盆1株。根据植物习性，当植物长到3～10 cm时，用化合物处理。化合物中添加3.6 mL环己酮+Wettol EM31(体积4∶1)乳化，用去离子水和2%表面活性剂(Dash HC，BASF SE, Ludwigshafen, Germany)稀释到相应喷雾量，用超声喷嘴喷雾器给植物喷雾。剂量对应于2、1、0.5 kg/hm2，应用量为750 L/hm2。在15～22 ℃培养21 d。用肉眼评估植物的症状，并与对照对比。

1.5 生理测试

用已报道的方法进行生理学研究。以叶绿素荧光为光合活性的指示物，在化合物处理后2和24 h用 Imaging-PAM-M-Series 调制叶绿素荧光成像技术测量。

2 结果和讨论

2.1 Malaria Box 化合物对96孔板中拟南芥种子作用和苗头化合物对土壤中种子或苗影响的分析

首先，笔者研究了Malaria Box中80个化合物以80 μM对琼脂中拟南芥种子发芽影响的筛选。在测试的这些化合物中 9个具有除草活性(图 1A)。9个苗头化合物的表型影响为延缓苗的发育(B、D、G和 I)、胚根出现后生长受抑制(A和 C)、褪绿/白化苗(E和 H)、萌发受抑制(F)。用聚类分析法比较了334个商业化除草剂与9个被选苗头化合物的2个理化特性(例如Log P、Log S、摩尔质量)(图1B)。也直接比较它们的理化特性与除草剂的平均情况。

所有的苗头化合物的特性与商业除草剂的一致。由于苗头化合物 A、E和 H商业购买不到，F(MMV000972)缺少适于修饰的结构，只有B、C、D、G和I被进一步研究了对土壤种植拟南芥的活性(图 1C)。研究了这些被选的苗头化物芽前(种子)和芽后(苗)在0～400 mg/L浓度对拟南芥的除草活性。有趣的为当应用于土壤后只有苗头化合物G有除草活性。土壤和琼脂试验间发现的差异与以前的研究结果相一致，这是由于植物没有能力从土壤中吸收化合物或降解物。

2.2 对MMV007978骨架的评估

为了以有效的方式评估苗头化合物 G(MMV007978，图1D)结构的哪部分决定其除草活性的大小，笔者购买了类似物，保留了类似物的二乙氧基苯基核心结构，但对噻吩基进行了修饰。对得到的所有类似物进行了首次分析以确保其保持商业除草剂相似的理化特性。测定了MMV007978的22个衍生物对土壤种植的拟南芥芽前和芽后活性，以MMV007978、DMSO和8个商业化除草剂为对照(图2)。与预期一样，8个商业化除草剂以不同剂量对拟南芥有除草活性。22个类似物中，化合物3、6、9、10、15、19和 22在视觉上的除草症状相似于MMV007978。对这些化合物和MMV007978又重复进行3次试验，测定了它们对拟南芥生长的抑制作用，确定这些化合物与其母体化合物的除草活性大小。如果母体分子和其所有衍生物(图2)没有芽前活性或芽前活性低，进一步测试被选类似物的芽后活性，试验浓度100、200和400 mg/L (图3)。与预期的一样，所有类似物都具有抑制作用，浓度为200 mg/L时抑制率为37.5%～90.3%，浓度为400 mg/L时抑制率为69.3%～94.3%(图3A)。浓度为100 mg/L时，化合物9、10、19和22比MMV007978显著有效，最高浓度时，被选类似物的活性没有 MMV007978的活性高(图3B)。

反之，如化合物1、2和8等具有较小的基本结构单元或12、13、14和21具有较大的基本结构单元，它们没有活性。环有5个或6个原子时对活性重要，总的来说因为具有这样大小的基本结构的化合物有活性。有意思的是，环中杂原子的数量增加化合物的活性会减弱，如化合物 16和 17，杂原子换为电负性氮原子也会使化合物活性下降。

2.3 对抑制作物田杂草的活性

为了进一步探究MMV007978的活性，评估了其对6种作物田杂草的活性，这些杂草有双子叶和单子叶杂草(图 4A)。MMV007978在低剂量对反枝苋(Amaranthus retroflexus)和狗尾草(Setaria viridis)有强的抑制活性，较高浓度对稗草的生长有强的抑制活性。对其他杂草只有最高浓度才有影响。

2.4 生理作用

用生理生测法研究了MMV007978的作用，以确定此化合物的作用机制(图 4B)。MMV007978对非自养粟猪殃殃(Galium mollugo)的细胞分裂生长有轻微影响，浓度为100 μM时抑制率为30%，此浓度时对光氧的单细胞绿藻(Scenedesmus obliquus)和稀脉浮萍(Lemna paucicostata)的生长有大的影响，10 μM时只有轻微影响。叶片绿色加深表明此化合物不直接影响光合作用。化合物对分离的白芥子(Sinapis alba)嫩芽几乎没有作用。Lepidum sativum在无光下发芽和在光下生长受到 60%的抑制(化合物浓度100 μM)，化合物对根的发育有明显的作用。化合物浓度为100和10 μM时对离体光系统II的光合电子运输(Hill reaction)有 45%的抑制作用。MMV007978对Lepidum sativum胚轴中表皮功能、鹅草(G. aparine)中二氧化碳同化作用、粟猪殃殃细胞悬浮液的呼吸、稀脉浮萍叶中叶绿素荧光、稀脉浮萍根中活性氧(ROS)的产生或浮萍根中线粒体功能没有影响。

图1 从Malaria Box确定的苗头化合物MMV007978

图2 对MMV007978的结构-活性分析

图3 MMV007978和有除草活性类似物芽后应用对拟南芥生长的影响

这些结果表明MMV007978对细胞分裂有直接抑制作用，因此抑制萌发过程。对希尔反应的作用好像只发生于离体系统，但如叶绿素荧光生测结果一样不直接抑制活体光合作用。比较 MMV007978和已知的商业化除草剂的作用发现它们之间没有直接的相似性。仅有的相似情况为氯苯胺灵和MMV007978对异养细胞和在萌发测试中有相似的作用，以及如对叶绿素荧光活性有强的影响所表明抑制活体光合作用。MMV007978的作用机制为与细胞骨架相互作用，也抑制光合作用。以前的研究表明MMV007978对许多动物、真菌和微生物没有毒性，但对多个发育阶段的疟原虫、柏氏疟原虫动合子和肺感染有抗疟疾活性。最近对Malaria Box化合物代谢对疟原虫的影响研究表明MMV007978影响P-型ATP酶4(PfATP4, PF3D7_1211900)，此酶是一些spiroindolone的靶标。现在还缺少证据直接证实 MMV007978是这种作用机制，但疟原虫中与PfATP4有30%～33%一致性的蛋白质可用于直接研究MMV007978的作用机制。总的来说，MMV007978具有化学新颖性，作为除草剂具有独特的生理作用，低毒，是可进一步研究的有吸引力的物质。

(A) 剂量(kg·hm－2) 苘麻 反枝苋 大穗看麦娘 野燕麦 稗草 狗尾草2.0 90 90 25 60 95 100 1.0 0 90 0 0 75 90 0.5 0 90 0 0 0 70

图4 MMV007978的除草活性试验和生理作用

2.5 总结

食品安全是21世纪最紧迫问题之一，需要新除草剂，特别是新作用机制的除草剂。本文笔者研究表明抗疟疾药物候选物MMV007978也具有除草活性，证实了许多抗疟疾药物有除草活性的推测；对化合物活性重要的基本结构单元对选择的单和双子叶杂草的除草活性重要，具有目前已知除草剂没有的生理作用。按照设想此结构骨架的开发将导致新除草剂的发现。

2019年起欧盟禁用农药320种

2019年1月1日起，欧盟将正式禁止含有化学活性物质的320种农药在境内销售，其中涉及我国正在生产、使用及销售的农药有62个品种(具体名单见http://www.chinapesticide.org.cn/hydt/11285.jhtml)。由于这些农药目前已广泛应用于水果、茶叶、蔬菜、谷物等生产中，因此使用这些农药的农产品在出口欧盟时，就可能被退货或销毁。