响应面优化纤维素酶对沙棘低聚糖提取率影响的研究

张磊　薛雨菲　王琳　孙乾　张爱琴　孔令明

[摘要]本试验以沙棘粕为原料，加入适量纤维素酶经酶解反应后得沙棘低聚糖，以低聚糖提取率为测定指标，同时采用单因素及响应面对酶解pH、酶解温度、酶解时间、酶添加量进行优化。结果表明：酶解pH为6，酶解温度为50℃，酶解时间为4.5h，纤维素酶添加量条件为0.4%，在此条件下测得沙棘低聚糖的提取率为42.81%，沙棘低聚糖的含量为84%。通过试验，对沙棘提取低聚糖工艺进行深入研究，利用响应面优化得出确定最佳条件，为进一步开放沙棘低聚糖的提取提供理论依据。

[关键词]沙棘粕；低聚糖；纤维素酶；响应面

中图分类号：TS249 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180320

沙棘属胡颓子科，又名黑刺、酸刺、沙枣。作为一种抗沙化植物，主要分布在我国西北、西南、华北等地区。沙棘具有抗肿瘤、抗心血管疾病和免疫调节等药用价值。在沙棘加工过程中，沙棘粕为沙棘籽脱脂后的工业废料，一般被丢弃，造成资源浪费。沙棘粕中含有较多纤维素，蛋白质含量为20%左右，糖分含量为11.35%左右，脂肪含量为10.9%左右，除此之外含有维生素、氨基酸等成分。沙棘粕中仍然富含黄酮、原花青素等物质，具有清除自由基、抗氧化等作用。如今，沙棘越来越引起学者们的关注，但目前有关于沙棘低聚糖提取工艺的研究较少，低聚糖作为生理活性物质，广泛用于营养保健、疾病防治、植物生长等方面。降解低聚糖的方法主要有化学法和酶解法两种。化学法对反应的进程不易控制，且利用此方法的产物不适宜直接应用在食品领域，而酶解法条件温和。文章在单因素的基础上研究了响应面分析纤维素酶协同提取沙棘粕低聚糖，对提取工艺进行优化，为沙棘籽粕中低聚糖资源更好地开发利用提供理论指导和实验依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

沙棘粕，沙棘籽经提油后剩余物；纤维素酶，南宁庞博生物工程有限公司，酶活力200 000U/g；DNS试剂，上海生工生物工程有限公司；葡萄糖，苯酚；柠檬酸，硫酸。所用试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

TU-1810PC型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；JB-3A型恒温磁力加热搅拌器，雷磁-上海仪电科学仪器股份有限公司；HH-S4型数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；AL204-1C型分析天平，上海梅特勒托利多仪器有限公司；TU-1810PC型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3试验方法

1.3.1原料预处理

低温脱脂后的沙棘粕多次洗涤除去其水溶性杂质，将原料烘干后干燥粉碎，过60目筛备用。

1.3.2低聚糖的制备

将粉碎过筛的沙棘粕粉加入一定体积的柠檬酸缓冲溶液，配制成底物质量分数为4%的悬浊液，调节其pH值后，加入适量的纤维素酶，在设定温度下选用磁力搅拌器搅拌加速酶解一定的时间，高温灭酶15min，冷冻干燥得到沙棘低聚糖粗提物。

1.3.3低聚糖总糖含量的测定

（1）标准曲线的绘制。采用苯酚硫酸法测样品中总糖含量，采用DNS法样品还原糖含量。

苯酚硫酸法标准曲线：准确称取标准葡萄糖10mg于100mL容量瓶中，配成0.1mg/mL的葡萄糖標准溶液。分别量取标准液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，各以蒸馏水补至2.0mL，摇匀后加入6%苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，震荡摇匀冷却，在室温条件下放置20min后于490nm测吸光值，以2.0mL水做空白，绘制苯酚硫酸法标准曲线。

DNS法标准曲线：将葡萄糖标准液（1mg/mL）0.2mL、0.4mL、0.6mL，0.8mL、1.0mL于15mL试管中，用蒸馏水补足至1.0mL，分别准确加入DNS试剂2mL，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到15mL刻度。在540nm波长下测定吸光度，绘制DNS法标准曲线。

（2）样品测定。沙棘低聚糖粗提物质量测定低聚糖提取率，并根据标准曲线回归方程得出总糖含量以及还原糖质量，根据以下公式计算得出低聚糖含量。

1.4酶法提取低聚糖粗提物的单因素及响应面实验设计

实验选取了纤维素酶解过程中的酶解pH、酶解温度、酶解时间、酶添加量为单因素，测定其低聚糖的提取率，在此单因素实验基础上采用四因素三水平的响应面分析法，以低聚糖的提取率为响应值，进行Box-Behnken中心组合试验设计，确定最优的低聚糖提取工艺。

2结果与分析

2.1苯酚硫酸法标准曲线

以葡萄糖为标品测得苯酚硫酸法标曲，如图1所示，可得线性回归方程：

2.2DNS葡萄糖标准曲线

以葡萄糖为标品测得DNS葡萄糖法标曲，如图2所示，可得线性回归方程：

2.3单因素实验结果

2.3.1酶解pH对沙棘低聚糖提取率的影响

在其他条件不变的情况下，即酶解温度为50%，酶解时间为3h，酶添加量为0.3%的条件下，改变酶解的pH值，沙棘低聚糖的提取率变化如图3所示。从图3中可以看出，沙棘的提取率随着pH的增大有大幅度的提高，但是在pH超过5.5后，提取率有所下降，可能是由于pH的过大会影响纤维素酶的酶活，从而降低了沙棘低聚糖的提取率，因此为了得到较高的提取率，酶解pH应控制在5.5左右。

2.3.2酶解温度对沙棘低聚糖提取率的影响

保持其他的影响因素不变，酶解pH为5，酶解时间3h，纤维素酶添加量为0.3%，测在不同温度下沙棘低聚糖的提取率，结果如图4所示。纤维素酶在温度为50%时，沙棘低聚糖的提取率达到最大值，在大于50%后提取率有剧烈的下降，主要是由于纤维素酶的温度高于60 qC易变性失活，导致低聚糖的提取率下降。

2.3.3酶解时间对沙棘低聚糖提取率的影响

在一定条件下，酶解的时间越长，酶解的程度越彻底，酶解的效果也会越好。保持酶解的其他条件不变，酶解温度为50%，酶解pH为5，纤维素酶的添加量为0.3%，逐渐增加酶解的时间，得到沙棘低聚糖提取率随酶解时间的变化如图5所示，但在酶解时间在4h后，随着酶解时间的延长，沙棘低聚糖的提取率提高不明显，可能是由于4h纤维素几乎都已酶解，考虑选4h为最佳酶解时间。

2.3.4酶添加量对沙棘低聚糖提取率的影响

保持其他的酶解条件不变，酶解温度为50%，酶解pH为5，酶解时间4h，调节纤维素酶的添加量，沙棘低聚糖的提取率如图6所示。可知在底物质量分数一定时，添加的纤维素酶越多，酶解越快，酶解的越彻底，但是纤维素酶添加到一定程度后，足以满足底物的酶解而达到平衡，过多的添加反而是一种浪费，并没有提高沙棘低聚糖的提取率，因此综合考虑纤维素酶的添加量应为0.4%。

2.4响应面试验结果

2.4.1响应面试验的建立

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合实验的设计原理，以酶解pH（X₁）、酶解温度（X₂）、酶解时间（X₃）、酶添加量（X₄）为自变量，以沙棘低聚糖的提取率（Y）为响应值，设计四因素三水平的响应面分析实验。实验因素和水平如表1所示。

2.4.2响应面试验结果与分析

采用Design-expert8.0软件对实验数据进行回归分析，得出的回归方程为：

方程决定系数（R²）为0.945 1，说明了该回归方程适用于沙棘低聚糖提取率的理论预测。响应面分析结果如表2所示，对所得方程做显著性检验与方差分析，结果如表3所示。

从表3可以得知该模型影响是极显著的（P<0.000 1），因变量和自变量之间线性关系显著，模型决定系数为0.945 1，说明模型能解释94.51%的响应值变化，拟合程度较好。失拟项P=0.237 0>0.05，不显著，说明其二次回归方程高度显著，能很好地对响应面进行预测。

从表3中可以看出该模型的一次项pH（X₁）、温度（X₂）、时间（X₃）影响极显著，酶添加量（X₄）影响不显著；二次项X₂²、X₃²、X₄²影响极显著，二次项X₁²影响显著；交互项X₁X₂、X₁X₃、X₂X₃<0.05，影响显著，交互项X₁X₄、X₂X₄、X₃X₄影響不显著。说明在试验中pH、温度、时间与酶的添加量交互作用小，无基本影响。各因素的影响顺序为pH>温度>时间>酶添加量。

2.4.3响应面分析

根据回归方程绘制出响应面和等高线图，考察拟合响应曲面的形状，反应各因素之间的交互作用，分析各因素对响应值的影响，结果如图7～图10所示。

响应面的曲面斜度确定两者对响应值的影响程度，倾斜度越高，说明两因素交互作用越显著。等高线的形状可以反映交互项的影响大小，等高线越密集，呈椭圆形，则表示两因素交互作用显著，圆形则表示两因素交互作用不明显。

由图7可以看出，随着pH和温度的增加，低聚糖提取率也随之上升，从等高线可以看出，呈现椭圆状，说明pH和温度因素相互作用显著，与回归方差分析结果相符。由图8可以看出，沙棘粕低聚糖提取率随着时间和pH的增加逐渐升高，时间和pH较高时，提取率的曲面较陡峭，从等高线图观察可知曲线呈椭圆状，说明时间与pH交互作用显著。由图9可以看出，曲面在添加量方向上升后下降，曲面未呈现伞状，说明添加量与pH的交互作用不显著。由图10可以看出，随着温度与时间的增加，曲面呈现陡峭上升，等高线呈现十分明显椭圆状，说明温度与时间的交互作用明显。

响应面优化试验得出最优条件为：酶解pH为5.95，酶解温度为49.83℃，酶解时间为4.51h，纤维素酶添加量为0.42%，在此条件下最大提取率42.95%。

3结论

根据苯酚硫酸法标准曲线与DNS葡萄糖标准曲线分别对沙棘粕低聚糖粗提物的总糖与还原糖进行测定，以低聚糖提取率为指标，应用Design-expert8.0软件，采用Box-Behnken建立了酶解pH（X₁）、酶解温度（X₂）、酶解时间（X₃）、酶添加量（X₄）之间数学模型，即：

所得回归模型与实际情况拟合度较高，具有实用价值。通过显著性试验，各因素的影响顺序为：pH>温度>时间>酶添加量。通过单因素试验和响应面试验确定沙棘粕低聚糖最佳提取条件为酶解pH为6，酶解温度为50℃，酶解时间为4.5h，纤维素酶添加量条件为0.4%，在此条件下测得沙棘低聚糖的提取率为42.81%，沙棘低聚糖的含量为84%。与模型预测值相差不大，提取效果较好。