新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物对结肠癌模型小鼠免疫功能的影响

李露 李伟 刘柏里 张海英 聂继红

摘 要 目的：研究新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物对结肠癌模型小鼠免疫功能的影响，为新疆阿魏属植物的进一步开发利用提供参考。方法：体外接种小鼠结肠癌CT-26.WT细胞复制小鼠结肠癌模型。将造模的50只小鼠随机分为模型组（生理盐水，灌胃）、顺铂组（5 mg/kg，腹腔注射）和新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物低、中、高剂量组（按生药量计分别为1.0、2.0、3.0 g/kg，灌胃），每组10只；另选10只正常小鼠作为空白组（生理盐水，灌胃）。顺铂组小鼠隔天给药1次，其余各组小鼠均每天给药1次，连续给药10 d。给药结束后，测定各组小鼠抑瘤率和脾指数；采用流式细胞术测定各组小鼠血液中T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+以及B淋巴细胞CD19+的数量，并计算CD4+/CD8+值；酶联免疫吸附法测定小鼠血清中免疫球蛋白M（IgM）、IgG的含量。结果：与空白组比较，模型组小鼠脾指数显著升高（P<0.01），但血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+细胞的数量以及血清中IgM、IgG含量差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物各剂量组小鼠的瘤质量均显著降低（P<0.01），抑瘤率均在40%以上；新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物中、高劑量组小鼠脾指数以及血液中CD3+细胞数量、CD4+细胞数量、CD4+/CD8+值和血清中IgM、IgG含量均显著升高（P<0.05或P<0.01）；新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物各剂量组小鼠血液中CD19+细胞数量显著减少（P<0.05或P<0.01），但血液中CD8+细胞数量差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物对结肠癌模型小鼠具有一定的改善作用，并可显著提高小鼠自身的细胞免疫能力和体液免疫能力。

关键词 新疆阿魏；乙酸乙酯部位；结肠癌模型；小鼠；免疫功能

中图分类号 R284 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）21-2939-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.14

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of the extract from ethyl acetate part of Ferula sinkiangensis on immune function of colon cancer model mice， and to provide reference for further development and utilization of plants of the genus Ferula. METHODS： Colon cancer model mice were induced by incubated with colon cancer CT-26.WT cell. 50 model mice were randomly divided into model group （normal saline， i.g.）， cisplatin group （5 mg/kg， i.p.） and ethyl acetate part of F. sinkiangensis low-dose， medium-dose and high-dose groups （1.0， 2.0， 3.0 g/kg， calculated by crude drug， i.g.）， with 10 mice in each group. Other 10 normal mice were included in blank group （normal saline， i.g.）. Cisplatin group was given medicine every other day， and other groups were given medicine once a day， for consecutive 10 d. After medication， the inhibition rate of tumor and spleen index were determined. Flow cytometry was adopted to detect the number of blood T lymphocyte subsets CD3+， CD4+， CD8+ and B lymphocytes CD19+； CD4+/CD8+ value was calculated. ELISA method was adopted to detect the content of immune protein IgM and IgG in serum of mice. RESULTS： Compared with blank group， spleen index of mice was increased significantly in model group （P<0.01）. There was no statistical significance in the number of CD3+， CD4+， CD8+ and CD19+ cells in the blood， as well as the contents of lgM and lgG in the serum （P>0.05）. Compared with model group， the tumor mass of mice in ethyl acetate part of F. sinkiangensis groups were significantly reduced （P<0.01）， inhibitory rate of tumor was more than 40%. The spleen index， the number of CD3+ and CD4+， CD4+/CD8+ value， the contents of IgM and IgG in serum were increased significantly in ethyl acetate part of F. sinkiangensis medium-dose and high-dose groups （P<0.05 or P<0.01）. The number of CD19+ cells in blood was decreased significantly in ethyl acetate part of F. sinkiangensis groups（P<0.05 or P<0.01）. There was no statistical significance in the number of CD8+ cells in blood （P>0.05）. CONCLUSIONS： The extract from ethyl acetate part of F. sinkiangensis shows inhibitory effect on colon cancer model mice， and can significantly improve cellular immunity function and humoral immunity function.

KEYWORDS Ferula sinkiangensis； Ethyl acetate part； Colon cancer model； Mice； Immune function

阿魏为伞形科植物新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）或阜康阿魏（Ferula fukanensis K.M.Shen）的树脂[1]，为新疆特色珍贵药材，在治疗肿瘤、风湿性关节炎、胃痛等方面有独特的优势[2-3]。本课题组前期研究已证实，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物能够有效抑制结肠癌肿瘤的生长[4]。随着对免疫系统与肿瘤作用关系的不断研究，发现肿瘤在发生发展过程中与机体的免疫功能异常有着非常密切的联系，机体免疫功能下降，可导致肿瘤转移、复发和预后效果差[5]。机体对肿瘤的免疫方式主要有细胞免疫、体液免疫和分泌细胞因子三种。在细胞免疫中，T淋巴细胞是最为重要的效应细胞，被认为是机体免疫系统对肿瘤的直接而又特异的识别者[6-7]，而T淋巴細胞又由多个不同的亚群（如CD3+、CD4+、CD8+等）组成，CD19+则用作标记B淋巴细胞[8]；体液免疫指标的变化也与肿瘤的发生发展有着密切的联系，当肿瘤发生时，机体处于免疫抑制状态，可能表现为体液免疫亢进，此时可以合成和分泌免疫球蛋白（如IgG、IgM等），执行机体的体液免疫[9-10]。在本研究中，笔者拟建立BALB/c小鼠结肠癌模型，从免疫角度出发，探讨新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物治疗小鼠结肠癌的作用机制，为新疆阿魏属植物的进一步开发利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

IX71-12FL/PH倒置荧光显微镜（上海赖氏电子科技有限公司）；TGL-16B离心机（上海安亭科学仪器厂生产）；GUAVAEASYCYTE 8HT流式细胞仪（美国Millpore公司）；xMarkTM酶标仪（美国Thermo公司）。

1.2 药品与试剂

新疆阿魏药材（批号：20161012）由新疆省伊犁州食品药品检验所提供；红细胞裂解液Lysing Buffer 10X Concentrate和CD3-别藻蓝蛋白（APC）、CD4-异硫氰酸荧光素（FITC）、CD8-多甲藻黄素-花青素5.5（Per-cy5.5）、CD19-藻红蛋白（PE）兔抗鼠、CD19单克隆抗体（武汉博士德生物制剂有限公司）；青-链霉素混合液（美国Hyclone公司，批号：F170221）；顺铂注射液（江苏豪森药业集团有限公司，批号：170402，规格：6 mL ∶ 30 mg）；IgM、IgG酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（美国Gibco公司，批号：均为466659）。

1.3 动物与细胞

健康BALB/c小鼠60只，♀♂对半，体质量18～24 g，4～6周龄，购自新疆医科大学动物中心，实验动物生产合格证号：SYXK（新）2011-0001；小鼠结肠癌CT-26.WT细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

2 方法

2.1 新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物的制备

取100 g新疆阿魏，在研钵中研碎成细颗粒状，过一号筛，以沸程为30～60 ℃的石油醚500 mL超声（频率53 Hz）提取40 min，以相同的方法将剩余残渣连续提取2次脱脂后，过滤得滤渣约90 g。取提取残渣，用95%乙醇回流提取3次，每次450 mL、提取1 h，合并3次滤液，减压浓缩后硅藻土拌样，用5倍量的乙酸乙酯超声（频率53 Hz）萃取5 min，静置后以抽滤瓶滤过，将滤液浓缩干燥，即得阿魏乙酸乙酯部位浸膏（得率为16.3%），并测得其中阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇C的含量分别为33.4、76.5、72.3 mg/g[11]。

2.2 造模、分组与给药

将小鼠结肠癌CT-26.WT细胞复苏，调整细胞密度为2×107个/mL，按0.1 mL/只分别接种于50只（♀♂对半）BABL/c小鼠左前肢腋窝下，复制结肠癌小鼠模型[12]。将造模的50只小鼠随机分为模型组、顺铂组和新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物低、中、高剂量组，每组10只（♀♂对半）；另取10只（♀♂对半）正常小鼠作为空白组。从造模第2天开始给药，给药前24 h禁食不禁水。新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物低、中、高剂量组小鼠每天灌胃1次相应药液1.0、2.0、3.0 g/kg（按生药量计，给药剂量根据本课题组前期研究[4]及预实验结果调整后设置），顺铂组小鼠隔天腹腔注射1次5 mg/kg顺铂无菌生理盐水溶液[4]，空白组和模型组小鼠每天灌胃1次生理盐水，连续给药10 d。在给药期间，因顺铂组3只小鼠死亡、阿魏乙酸乙酯部位提取物高剂量组2只小鼠死亡，为了保证结果的均一稳定性，调整每组小鼠为7只。

2.3 抑瘤率和脾指数的测定

末次给药1 h后，称小鼠体质量，摘眼球取血，然后将小鼠处死，剥取左前肢皮下的瘤块并称质量（g），计算各组小鼠的抑瘤率[抑瘤率（%）=（模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量）/模型组平均瘤质量×100%]。解剖小鼠，取脾组织，用吸水纸吸干水分，称质量并计算各组小鼠的脾指数[脾指数=脾质量（mg）/体质量（g）]。然后将各组织置于-80 ℃冰箱中保存，备用。

2.4 血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+细胞数量的检测

采用流式细胞术进行检测。吸取小鼠血样100 ?L，置于2 mL不含肝素的EP管中，做好标记，分别加入2 ?L的CD4-FITC抗体和5 ?L的CD3-APC、CD8-Per- cy5.5、CD19-PE兔抗鼠抗体，振荡混匀，室温下避光反应15 min。然后在每个样品中加入1.5 mL的红细胞裂解液Lysing Buffer 10X Concentrate，染色，振荡混匀，4 ℃下避光静置15 min，再以1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀加入1 mL的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次，然后加入0.5 mL的PBS稀释，混匀，上机检测血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+细胞的数量，并计算CD4+/CD8+值。

2.5 血清中IgM、IgG含量的测定

采用ELISA法进行检测。将血液在室温下静置1 h左右，然后在4 ℃下以1 000 r/min离心10 min，收集血清。按照相应试剂盒说明书操作，检测各组小鼠血清中IgM、IgG含量。操作结束后，在酶标仪上测量450 nm波长下各孔的光密度（OD）值，进行定量分析。

2.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析。实验数据用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析和Scheffe检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠瘤质量和抑瘤率的测定结果

与空白组比较，模型组小鼠瘤质量显著增加（P<0.01）。与模型组比较，各给药组小鼠瘤质量均显著降低（P<0.01）。新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物各剂量组小鼠的抑瘤率均达到40%以上，且抑瘤效果具有一定的量效关系，高剂量新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物的抑瘤效果與阳性药物顺铂相当。各组小鼠瘤质量和抑瘤率测定结果见表1。

3.2 各组小鼠脾指数的测定结果

与空白组比较，模型组小鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05），但脾质量和脾指数均显著增加（P<0.01）。与模型组比较，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物各剂量组小鼠体质量差异均无统计学意义（P>0.05），而顺铂因具有一定的化学毒性，顺铂组小鼠的体质量显著减轻（P<0.01）；新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物中、高剂量组小鼠的脾指数均显著升高（P<0.01）。各组小鼠脾指数测定结果见表2。

3.3 各组小鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+细胞数量的测定结果

与空白组比较，模型组小鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+细胞数量差异均无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，顺铂组和新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物中、高剂量组小鼠血液中CD3+、CD4+细胞数量均显著增加（P<0.05或P<0.01），新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物各剂量组小鼠血液中CD19+细胞数量显著减少（P<0.05或P<0.01），并且新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物中、高剂量组小鼠血液中CD4+/CD8+值显著升高（P<0.05或P<0.01），各给药组小鼠血液中CD8+细胞数量差异均无统计学意义（P>0.05）。小鼠血液中CD3+细胞检测的流式直方图见图1和CD4+、CD8+、CD19+细胞检测的流式散点图见图2，测定结果见表3。

3.4 各组小鼠血清中IgM、IgG含量的测定结果

与空白组比较，模型组小鼠血清中IgM、IgG含量差异均无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，顺铂组和新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物低剂量组小鼠血清中IgM、IgG含量差异均无统计学意义（P>0.05），但新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物中、高剂量组小鼠血清中IgM、IgG含量均显著增加（P<0.05或P<0.01），这提示新疆阿魏乙酸乙酯部位能够提高结肠癌模型小鼠机体的体液免疫功能，且具有明显的剂量依赖性。各组小鼠血清中IgM、IgG含量测定结果见表4。

4 讨论

《抗肿瘤药物药效学指导原则》[13]规定，当天然药物对肿瘤的抑制率大于40%时，就可判定其有一定的抗肿瘤作用。本研究结果显示，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物对结肠癌模型小鼠的抑瘤率分别为45.35%、80.59%、93.61%，均高于40%，提示该部位对结肠癌具有抑制作用。脾是重要的免疫器官，常被用来评估机体的免疫功能，脾指数也被当作参考判断实验药物是否对机体的免疫功能有所提高的一项指标[14]。在本研究中，中、高剂量新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物可显著提高结肠癌模型小鼠的脾指数，由此推测造模中小鼠接种肿瘤后，小鼠对肿瘤的排斥所产生的免疫功能增强，所以使得脾指数有所增加，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物抑制结肠癌异位瘤与提高小鼠自身免疫应答有一定的关系。

细胞免疫在机体免疫对抗肿瘤中扮演着主要的角色[15]，而作为细胞免疫最重要的T淋巴细胞，则通过功能各异的T淋巴细胞亚群来发挥免疫调节作用。 其中，CD3+细胞分布在每个T淋巴细胞中，代表T淋巴细胞的总数，还可以作为鉴别T淋巴细胞的指标[16]。CD4+细胞主要是辅助体液免疫和细胞免疫，如果CD4+细胞的表达水平降低，那么免疫反应的诱导作用也会随之降低，随之机体的抗肿瘤能力也会降低[17]。CD8+细胞在免疫过程中起负调节作用，可抑制机体自身抗体的生成，是一种抑制性T淋巴细胞[18]。CD4+/CD8+值越低，越容易导致机体的免疫功能受损，识别和杀伤突变细胞的能力将下降，继而为肿瘤迅速生长、转移、继发感染创造条件[19]。本研究流式细胞术检测结果显示，中、高剂量新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物和顺铂均显著增加了小鼠血液中CD3+、CD4+细胞的数量，表明用药后结肠癌模型小鼠存在免疫功能提高的现象；且中、高剂量新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物能升高模型小鼠血液中CD4+/CD8+的值，说明用药后结肠癌模型小鼠的细胞免疫功能处于免疫亢进状态，机体识别杀伤突变细胞的能力有所上升。CD19+细胞是由B淋巴细胞分泌的，具有两个功能：一是能够抑制反应性T淋巴细胞的活性；二是能够抑制效应T淋巴细胞的增殖以及免疫球蛋白的产生，从而参与细胞免疫的过程[20]。CD19+细胞数量越多，机体效应T淋巴细胞活性就越低。本研究结果显示，新疆阿魏乙酸乙酯部位各剂量组小鼠血液中CD19+细胞数量较模型组均显著减少，表明新疆阿魏乙酸乙酯部位可能是通过降低小鼠体内CD19+细胞数量，来增加小鼠体内效应T淋巴细胞活性及免疫球蛋白的数量，从而参与机体的细胞免疫调节。

免疫球蛋白同T淋巴细胞亚群一样，属于机体免疫防御机制的重要组成部分。当B淋巴细胞受到抗原刺激时就会分泌免疫球蛋白（如IgA、IgM、IgG），这些抗体对B淋巴细胞的相关抗原进行识别，促进细胞与病原体的结合，进行体液免疫[21]。血清中免疫球蛋白的主要组成是IgG，其可激活补体以及调理吞噬功能，在机体二次免疫应答中扮演主要角色。本研究结果显示，中、高剂量新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物均显著提高了模型小鼠血清中IgM、IgG的含量，表明其提高了小鼠自身的体液免疫能力。

笔者选用抗腫瘤研究中最常用的顺铂为阳性对照，虽然顺铂抗肿瘤作用强，但是其是一种细胞非特异性药物，是通过破坏细胞DNA 的功能而发挥作用的，所以其对机体免疫作用可能影响不大。在肿瘤形成过程中，恶变细胞在某些情况下能通过多种机制逃避机体的免疫监视，在体内迅速增殖，形成肿瘤[22]，这也可能是本研究中模型组小鼠各免疫指标与空白组比较没有显著差异的主要原因。但是用药后反而可能刺激机体免疫的产生，这与本研究给药后小鼠免疫水平升高的结果相吻合。另外，本研究结果显示，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物给药后小鼠血液中CD8+细胞数量略有下降，而CD8+细胞数量越低表示免疫抑制越强，即小鼠的抵抗力就越强，这说明了小鼠机体内还处于自身免疫抗肿瘤状态。

综上所述，新疆阿魏乙酸乙酯部位提取物对结肠癌模型小鼠具有较好的抑瘤作用，这可能与提高小鼠自身的细胞免疫和体液免疫能力有关。

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（收稿日期：2018-05-23 修回日期：2018-08-24）

（编辑：林 静）