新城疫病毒为疫苗载体的研究进展

董东晓 张东超 张文壮

摘要：文章综述了新城疫病毒（NDV）的分子生物学特征、基因组结构，同时，重点介绍病毒载体的研究进展、反向遗传学、新城疫病毒载体的应用研究进展等，为新城疫病毒载体的后续研究奠定了基础。

关键词：新城疫病毒；反向遗传学；载体

中图分类号：S852.65 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.00

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus， NDV）引起的一种禽类的急性、高度接触性、烈性传染病[1]。不仅对我国养禽业带来巨大损失，在世界范围的危害也极大。弱毒苗和灭活苗虽然能有效控制该病，但它们都还存在一定的缺陷，新城疫基因工程苗相对优越于传统苗，所以，新城疫基因工程苗开始引起重视。随着反向遗传学的建立[2]，新城疫病毒载体疫苗的研发逐渐活跃起来，为构建新城疫和其他禽病的多联苗奠定了基础。

1 新城疫病毒分子的生物学特性

新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）为不分节段单股负链 RNA 病毒 （non segment negativesigle strain virus），本身不能作为 mRNA，不带译制病毒蛋白的信息，必须通过病毒自己的 RNA聚合酶转录出一股互补链作为 mRNA。新城疫病毒的负链 RNA，一方面转录成 mRNA，合成相应的病毒蛋白成分， 另一方面转录成其互补链 ，再合成病毒 RNA 链，参与病毒包装。新城疫病毒粒子中心是一个与蛋白质相连接的单股负链 RNA所形成的螺旋形核衣壳，外包一双层脂质囊膜，内衬有一层特殊的 M蛋白，囊膜外有大小2种糖蛋白纤突，前者具有血凝素和神经氨酸酶活性的 HN 蛋白组成，后者具有融合功能的 F蛋白组成。

1.1 新城疫病毒的形态特征

新城疫病毒又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽脑肺炎病毒，属于副粘病毒科、副黏病毒亚科、腮腺病毒属、禽副粘病毒I型（APMV-I）。成熟的新城疫病毒粒子的直径为100～250 nm，由囊膜和核衣壳两部分构成，囊膜是宿主细胞外膜脂类与病毒糖蛋白结合而形成的，表面有刺突，刺突长为8～12 nm，核衣壳是由病毒核酸和蛋白质衣壳粒结合后，对称螺旋缠绕而成，直径约为18 nm。新城疫病毒的核酸为单链负股、不分节RNA[3]（non segment negative single-stranded RNA，ssRNA）。

1.2 新城疫病毒的基因组结构

如图1所示，新城疫病毒的基因结构包括NP、P、M、F、HN和L6个基因，基因组全长约为15kb；在基因组开放阅读框（ORF）外侧的3端有长为55nt的引导序列，5端有长为114nt或56nt的尾随序列。6个基因分别编码核衣壳结构蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素神经氨酸酶（HN）和大蛋白（L），leader序列和trailer序列在转录和复制中起到对基因组的调控作用。基因组所编码的蛋白中HN、F、M蛋白为外部蛋白，F和HN蛋白位于囊膜的表面，M蛋白即与外膜蛋白相连，又与核衣壳相接。F蛋白在蛋白酶的作用下由前体F0裂解成F1和F2[4]，才能激发病毒的囊膜与宿主细胞膜融合，使病毒具有感染力；HN纤突蛋白中HA（血凝素）可识别唾液酸受体并与之结合，NA（神经氨酸酶）具有切除病毒表面的唾液酸将组装好的病毒粒子与宿主分离的功能；蛋白对病毒囊膜的形成有重要作用，其功能在于参与病毒的组装和调节病毒RNA的合成，使病毒具有感染性。NP蛋白、P蛋白、L蛋白为内部蛋白，与病毒RNA复合形成病毒的核衣壳；没有内部蛋白参与，RNA不能进行转录和复制；病毒RNA的转录和复制需要内部蛋白的共同参与，形成具有活性的mRNA。

2 病毒载体的研究进展

近年来，随着分子生物学的迅速发展，活载体疫苗已被广泛研究和应用，它不仅克服了灭活苗的免疫性差和弱毒苗的毒力返强，而且具备了灭活苗安全性好和弱毒苗可产生局部免疫的优点，与此同时，活载体疫苗还具有构建多价苗和多联苗的优点。在生物界中，病毒是最为简单的微生物，因此，病毒载体为载体疫苗的研究和应用拓展了新思路。病毒分子生物学的研究逐渐成为热门，尤其基因重组等技术的建立使各种病毒作载体成为可能，研究已发现有多种病毒可作为安全可靠的载体，如痘病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、反转录病毒载体及副粘病毒载体等。

2.1 痘病毒载体

痘病毒为最大的DNA病毒，结构复杂，有核心、侧体和包膜，呈砖形或椭圆形。痘病毒核酸为单线双链DNA，基因组长130～300kb[5]。

痘病毒为载体在畜禽疫苗上研发和应用极其广泛，从牛痘病毒可以预防人类天花，到痘疫苗代替牛痘病毒，再后来通过基因工程对豆苗病毒进行致弱，为痘病毒载体的构建奠定基础。将牛瘟病毒基因组上的H基因重组到痘苗病毒基因组上进行表达，以及禽痘病毒基因组上重组新城疫、马立克等病毒的基因片段表达。另外，修飾豆苗病毒安卡拉、豆苗病毒稿件痘苗、金丝雀痘病毒、粘液瘤病毒、猪痘病毒、山羊逗病毒等作载体也有相当多的研究。

2.2 腺病毒载体

腺病毒属于腺病毒科，包括禽病毒属和哺乳动物腺病毒属。腺病毒核酸是由线状双股DNA组成，外无囊膜，而是20面体的蛋白衣壳；衣壳由240个六邻粒和12个五邻粒组成，六邻粒构成20面体的20个面及棱，五邻粒分别位于20面体的12个顶点。腺病毒的基因组长为36kb。

腺病毒腺病毒的基因组较大，具有能容纳相当大片段的外源基因的潜力；而且对插入的外源基因高效表达的突出优点。目前对猪、绵羊、牛、犬、禽等腺病毒作载体研究相对成熟，也已取得很大的成果，如猪腺病毒为载体重组猪瘟病毒表达gp55蛋白等；禽腺病毒为载体分别重组鸡传染性法氏囊病毒表达VP2蛋白、鸡传染性支气管炎病毒表达纤突蛋白，等等。

2.3 疱疹病毒载体

疱疹病毒科有4个亚科：甲、乙、丙及未定名亚科。疱疹病毒是中小型双股DNA病毒，疱疹病毒的基因组约为150kb。

疱疹病毒一般经黏膜途径感染宿主，因此，疱疹病毒载体疫苗的可通過黏膜接种免疫。目前疱疹病毒或载体主要有牛疱疹病毒I型和Ⅳ型、犬疱疹病毒、火鸡疱疹病毒、马立克病病毒、传染性喉气管炎病毒、伪狂犬病病毒等。伪狂犬病毒载体疫苗应用相对比较成熟的载体，如将经典猪瘟病毒、口蹄疫病毒、传染性胃肠炎病毒、圆环病毒-2、猪流感病毒、寄生虫等基因片段重组到伪狂犬病毒基因组表达相应的抗原。

2.4 逆转录病毒载体

逆转录病毒是RNA病毒的一种，核心呈对称的20面体，核心有核糖蛋白，外有囊膜包裹。核酸由双股正链RNA构成。

一般逆转录病毒载体和包膜蛋白以及包装细胞系共同组成反转录病毒表达系统，具有对重组基因高效表达的能力。逆转录病毒作载体可以感染各种细胞，而且感染率比较高，可达100%；而且转入的外源基因可以完全整合。哺乳动物及鸟类中存在许多逆转录病毒，如鼠类的乳腺肿瘤病毒，莫洛氏小鼠白血病病毒，鸟类脾坏死病毒等，目前，对劳斯肉瘤病毒研究最为清晰。

2.5 副粘病毒载体

副粘病毒形状多样，直径100 nm以上，病毒由囊膜和核衣壳构成，核衣壳由一条连续的负股RNA单链及蛋白结合，呈螺旋对称。

随着反向遗传学的建立，反向遗传学技术的发展，越来越多的RNA病毒载体成为可能，尤其是副粘病毒载体的研究比较活跃。目前副粘病毒科中新城疫病毒载体的研究已比较成熟，如以新城疫病毒为载体插入氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因、绿色荧光蛋白（GFP）基因、禽流感病毒HA基因、传染性法氏囊病毒VP2基因等，都能将外源基因高水平的表达。

3 新城疫病毒为载体的研究进展

3.1 反向遗传操作技术

反向遗传学（reverse genetics）是相对于经典的遗传学而言的。反向遗传操作技术也叫感染性cDNA克隆技术，是将病毒RNA逆转录为cDNA，在病毒的cDNA水平上进行体外基因改造（如基因位点的突变、插入、缺失、转换等），再将包装好的病毒基因或直接转染到细胞或易感宿主中，拯救出具有感染性RNA活的病毒或类似病毒的物质，根据拯救出的新病毒的表现特性研究RNA病毒基因组的结构、功能及研究应用等，通常又被称为“病毒拯救（the rescue of virus）”，主要包括RNA干扰技术、基因沉默技术、基因体外转录技术等。反向遗传学技术在新城病毒载体上的应用已相对成熟。

3.2 新城疫病毒作载体的优点

重组新城疫病毒作为活病毒载体的优点极多。新城疫病毒为负链RNA病毒，不能通过DNA复制，从RNA到RNA，并且整个复制过程在细胞浆中进行，病毒基因组将不会整合到宿主基因组中，所以，新城病毒作载体的安全性要高于DNA病毒作载体。NDV病毒作载体能很好的刺激病毒宿主产生体液免疫和细胞免疫以及局部黏膜免疫，对机体有较强的免疫保护；并可以长时间表达抗原基因，维持产生的高抗体滴度。由于新城疫存在普遍性，新城疫已为家禽防疫的重点病之一[6]，所以，重组新城疫病毒做活病毒载体有极大的经济价值。新城疫弱毒苗生产成本低廉，而且新城疫疫苗的接种方式很多（滴鼻、点眼、喷雾、饮水、注射等），使用很方便。新城疫的遗传特性相对稳定，只有一个血清型，毒株间的重组及毒力返强的可能性较小。NDV病毒对人没有感染性，野生型新城疫病毒也仅会引起有轻微的病症，因此，弱毒新城疫对人是安全的。由于新城疫病毒在的优点诸多，而且反向遗传系统的建立，新城疫病毒作载体的研究越来受重视。

3.3 新城疫病毒为载体的应用研究进展

2000年，Krishnamurthy和Huang[7]等将氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因插入由中等毒力菌株Beaudette C重组的rNDV/BC基因组HN和L之间而获得重组新城疫病毒rNDV/BC/CAT，并发现全长新城疫病毒cDNA的改变会影响rNDV的复制，但外源基因的插入使Beaudette C的毒力减弱[13]。后来，又以新城疫弱毒Lasota株为载体，在其基因组3端紧靠NP基因插入CAT基因，获得重组新城疫病毒rLasota/CAT，并证明在新城疫病毒基因组的3端插入外源基因不影响其亲本毒力。一系列的研究表明新城疫病毒可以作为一种新的活疫苗载体。

2003年，Engel-Herber[8]等以NDVClone-30株为载体，将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入到载体基因组F基因和NH基因之间，重组获得新城疫病毒rNDV/GFP1，并发现获得的rNDV/GFP1和亲本病毒株在鸡胚中的复制能力及致病性基本一致，而且新的重组病毒能在鸡胚中稳定的表达GFP。另外，在新城疫病毒感染细胞试验中，感染病毒rNDV/GFP1株的细胞能检测到GFP，而感染病毒Clone-30株的细胞不能表达GFP[14]。这对研究新城疫病毒病毒跟踪奠定基础，可以根据GPF的特性对病毒侵袭宿主的组织器官以及严重程度确定，同时，再次证明新城疫病毒是一种非常有前景的活疫苗载体。

2003年，Zhao[9]等将人的分泌型碱性磷酸酶（SEAP）基因分别插入到新城疫病毒基因组的NP与P基因之间、M与F基因之间、HN与L基因之间以及L基因之后，获得4株重组新城疫病毒株（rNDV/SEAP/NP-P、rNDV/SEAP/M-F、rNDV/SEAP/HN-L、rNDV/SEAP/L），以无毒株NDFL为亲本对照进行研究试验，发现重组新城疫病毒株产生的病毒滴度要低于亲本毒株的抗体滴度，而且前，3株毒株对SEAP的表达量高于第4株重组新城疫毒株对SEAP的表达量[15]。感染鸡胚成纤维细胞（CEF）产生的蚀斑结果也相似，另外，重组新城疫病毒的复制的起始时间相对亲本毒株有所延迟，尤其是rNDV/SEAP/NP-P毒株。研究中的外源基因插入不同的位点，外源基因的表达量不同，而且对新城疫病毒产生的抗体滴度的影响也不同。因此，这对研究以新城疫病毒为载体，插入外源基因的合适位点有一定的指导意义；另外，也对新城疫病毒为载体插入多个外源基因构建多联苗奠定基础。

2004年，Huang等以新城疫病毒弱毒Lasota株为骨架，将鸡传染性法氏囊病毒变异株IBDV/GLS-5的VP2基因插入到Lasota基因组的3端，获得重组新城疫病毒rLasota/VP2。该毒株对2日龄SPF雏鸡免疫试验结果显示：rLasota/VP2可以对IBDV/GLS-5株和强度NDV/Texas株产生90%以上的保护力；若加强免疫，保护力可达到100%。试验首次展示了构建新城疫病毒作其他病毒的疫苗的载体实例，证明了新城疫病毒作载体疫苗的可行性。

2006年，葛金英等将野生突变型H5亚型高致病性禽流感的HA基因插入到新城疫病毒Lasota株的P和M基因之间，获得重组病毒rLasota-HAmut。另外，通过免疫学试验证明，rLasota-HAmut作为载体疫苗具有良好的免疫原性及安全性[16]。Veits等将H5亚型的HA基因的开放阅读框（ORF）插入到NDV Clone-30基因组的F和HN基因之间，再通过对ORF进行基因改造，获得重组毒株NDVH5m。并通过试验证明，NDVH5m可作为较为合适的载体疫苗选择株。

2008年，葛金英等以NDV Lasota弱毒株为载体，将超强传染性法氏囊（vvIBDV）的VP2基因插入到Lasota株基因组P基因和M基因之间，拯救出病毒rLasota-VP2株。通过重组病毒鸡胚生长特性试验，发现该毒株具有和亲本Lasota毒株在鸡胚中重高滴度和低致病力的特性；致病性试验结果显示，重组病毒有极高的稳定性；对7日龄雏鸡免疫试验结果发现，重组rLasota-VP2对新城疫强度F48E9株有100%的免疫保护力，对vvIBDV Gx株的保护力力在90%以上[17]。试验为研制新城疫和传染性法氏囊病二联苗奠定基础，此研究再次强有力的说明了新城疫病毒载体的可行性。

2009年，Nayak B等以NDV Lasota为载体，重组高致病性禽流感的HA基因，获得rNDV-HA，并证明该重组株对H5N1亚型禽流感及强毒新城疫有较强的保护力。同年，胡顺林等和陈化兰等也做了类似的试验，并获得理想的结果[18]。

2010年，天津农学院焦利红[12]以NDV弱毒苗rLasota和突变修饰的变异株rLasota-FmF为载体，将IBV Masasachusetts41株的S基因分别插入到rLasota的P和M基因之间，将S1基因分别插入到rLasota和rLasota-FmF的P和M基因之间，分别拯救出重组新城疫病毒rL-IBVS、rL-IBVS1和rL-FmF，这将为构建NDV载体的ND和IB二联苗奠定基础。

4 展望

近年来，新城疫病毒的生物学特性及基因结构等研究已较为清晰。伴随反向遗传学技术的更新，新城疫病毒作为载体研究已取得较为显著地成就，为预防新城疫的同时预防其他禽病开辟了新思路。另外，新城疫病毒载体的研究相对其他RNA病毒载体的研究较为成熟，且新城疫病毒载体的安全性有着得天独厚的优势，由此可见，新城疫病毒载体的前景会越来越广阔。

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