苍术黄柏药配伍规律对药效物质的影响

朱培霞 易成文 周翠

摘要目的：探討苍术黄柏药的配伍规律对药效物质的影响，阐释中药合理配伍的科学内涵。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱分析进行线性关系分析以及加样回收率试验考察HPLC的严谨性。HPLC指纹图谱：取小檗碱和黄柏碱对照品溶液和苍术黄柏1∶1、1∶2、1∶3、0∶1、2∶1、3∶1、1∶0等不同配伍供试品溶液进行HPLC指纹图谱分析。结果：以苍术黄柏供试品溶液获取的HPLC色谱图中小檗碱和黄柏碱的保留时间与对照品外标法一致。1024～1024 μg范围内线性关系良好。加样回收率试验结果中平均回收率为9980%，RSD为20%，显示加样回收率试验良好，HPLC严谨性高。苍术黄柏不同配伍规律中非共有峰面积以3∶1配伍比例为最高为1062%，其次是1∶1配伍比例为806%。结论：苍术黄柏配伍不同配伍规律中3∶1配伍比例对小檗碱的影响最小，临床组方中发挥的黄柏作用药效就较好；从而说明中药配伍和药物剂量对于充分发挥药物疗效至关重要。

关键词高效液相色谱法，苍术，黄柏，配伍规律，药效物质

Study on Effects of Compatibility Regularity of Rhizoma Atractylodis and Cortex Phellodendri on Pharmacodynamic Substance

Zhu Peixia1， Yi Chengwen2， Zhou Cui1

（1 Department of Pharmacy， Xinyang Hospital of Traditional Chinese Medicine， Henan 464000， China； 2 Department of Pharmacy， Xinyang Central Hospital， Henan 464000， China）

AbstractObjective：To explain the scientific connotation of the rational compatibility of Chinese herbal medicine based on the HPLC analysis， and discuss the effects of compatibility regularity of Rhizoma Atractylodis and Cortex Phellodendri herbs on pharmacodynamic substance. Methods：The linear relationship was analyzed by HPLC and the sample recovery test was used to investigate the preciseness of HPLC. HPLC fingerprint： berberine and phellpdendrine comparison liquor， and Atractylodes rhizome and Cortex Phellodendri were used to make the test solution by the proportion of 1∶1， 1∶2， 1∶3， 0∶1， 2∶1， 3∶1， 1∶0， which were analyzed by HPLC fingerprint. Results：1） The retention time of berberine and phellpdendrine in Atractylodes rhizome and Cortex Phellodendri test solution was consistent with external standard method of control products by HPLC chromatogram. 2） The linear relationship was good in the range of 1024 to 1024 μg. 3） The average recovery rate of sample recovery teste was 9980%， and RSD was 2%， which showed that the sample recovery rate was good， and HPLC had a high conscientiousness. 4） In the different compatibility rules of Rhizoma Atractylodis and Cortex Phellodendri， the non common peak area was the highest with the ratio of 3∶1 compatibility to 1062%， followed by 1∶1， the proportion of compatibility was 806%. Conclusion：The effect of 3∶1 compatibility proportion of Atractylodes rhizome and Cortex Phellodendri has the minimum effect on berberine， and Cortex Phellodendri has a good pharmaceutical effect， indicating the compatibility and drug dose play an important role in giving full play to the effects of the drugs.

Key WordsHPLC； Rhizoma Atractylodis； Cortex Phellodendri； Compatible regularity； Pharmacodynamic substance

中图分类号：R282文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.051

复方配伍是根据中医辨证论治理论的一种中医药用药特色，而药对配伍是临床上常用的相对固定的2味药或3味药的配伍形式。药对配伍组成多具有一定规律，研究药对配伍有助于揭示中医学流传下来的方剂配伍的科学内涵，帮助临床医师和药师从具有引导价值和点面结合的科学意义[13]。苍术为菊科苍术属多年生草本植物苍术的干燥根茎，具有燥湿、化浊、止痛等功效，其主要有效成分为挥发油、苍术醇化合物。黄柏为菊科植物黄柏的干燥树皮，具有清热、解毒、燥湿功效，黄柏又名黄檗，其药用部分为是芸香科黄檗属落叶乔木的树皮内层入药，其中主要含小檗碱和黄柏碱化合物等。临床常用苍术黄柏配伍，经典的方剂有二妙散，为治疗湿热下注之基础方，方中以苍术黄柏配伍共奏清热燥湿，标本兼顾之效[4]。本实验以苍术黄柏配伍不同比例配伍，采用高效液相色谱法（HPLC）以黄柏碱和小檗碱作为对照品，探讨苍术黄柏配伍变化规律对药效物质的影响，为该方在临床上的合理应用及进一步开发奠定基础。

1材料

Agilent 1100型高效液相色谱仪；250 mm×46 mm，5 μm的色谱柱（Waters C18柱）；购于中国药品生物制品鉴定所盐酸小檗碱对照品（批号：110713200911）；购于北京世纪奥科生物技术有限公司黄柏碱对照品（批号：must11062401）。

2方法

21色谱条件精密量取10 μL的样品进样量或对照品溶液，采用250 mm×46 mm，5 μm的色谱柱（Waters C18柱），在乙腈和01%磷酸的流动相中，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，根据高效液相色谱法（HPLC）（Agilent 1100型高效液相色谱仪）指纹图谱的梯度洗脱程序进行试验。见表1。

22供试品溶液制备苍术为菊科苍术属多年生草本植物的干燥根茎，黄柏为菊科植物黄柏的干燥树皮，苍术黄柏采用1∶1、1∶2、1∶3、0∶1、2∶1、3∶1、1∶0等不同配伍规律，采用回流法煎煮，于敞口药盆中称取黄柏始终未3 g，根据不同配伍规律，配伍苍术黄柏加200 mL水，浸泡30 min，煮沸后文火45 min，取100 mL药液，在60 ℃下减压浓缩，定容至50 mL，折合柴胡黄芩药物水煎液浓度未02 g/ mL。取5 mL柴胡黄芩浓缩液用100%甲醇定容10 mL，混合均匀，取2 mL离心取上清液在045 μm超微膜滤过即可制备苍术黄柏配伍供试品溶液。

23对照品溶液制备精密称取购于中国药品生物制品鉴定所盐酸小檗碱对照品（批号：110713200911）、购于北京世纪奥科生物技术有限公司黄柏碱对照品（批号：must11062401）置于容量瓶中，甲醇溶解，制成0422 mg/mL小檗碱对照品溶液和0411 mg/mL黄柏碱对照品溶液。

24高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱分析

241HPLC方法学严谨性考察1）线性范围试验[5]：根据11制备的小檗碱对照品溶液，精密取0 μL、2 μL、6 μL、8 μL、16 μL、20 μL，分别编号1～6并连续进样，以峰面积为Y轴，5 μL进样浓度为X轴，绘制标准曲线，并根据对照品的回归方程计算各有效成分在各自浓度范围内的线性关系。2）加样回收率试验：取6份同一配伍比例1∶1苍术黄柏供试品溶液，根据11制备的供试品溶液，编号AF并分别加入2 mL对照品溶液，计算供试品在HPLC中的加样回收率。

244指纹图谱取苍术黄柏配伍供试品溶液、对照品溶液和缺苍术的阴性对照溶液，分别精密吸取5 μL根据色谱条件依次测定并记录色谱图。

25数据处理根据国家药典委员会提出的中药指纹图谱相似度评价系统2004A进行相似度分析，采用MATLAB软件进行数据处理和统计。

3结果

31对照品溶液HPLC色谱图采用对照品溶液获得HPLC色谱图得小檗碱和黄柏碱的保留时间分别为396 min和191 min，并且与其他组分分离良好。见图1。以苍术黄柏供试品溶液获取的HPLC色谱图中小檗碱和黄柏碱的保留时间与对照品外标法一致。见图2。

32线性关系考察结果在线性关系考察中以苍术甲苷进样量的自然对数为横坐标（lgX），峰面积的自然对数为纵坐标（lnY）进行回归，得回归方程lnY=1508 2lgX+13918（r=0999 7），因此在1024～1024 μg范围内线性关系良好。

33加样回收率试验结果加样回收率试验结果中平均回收率为9980%，RSD为20%，显示加样回收率试验良好，HPLC严谨性高。见表2。

34苍术黄柏不同规律配伍前后指纹图谱苍术黄柏采用1∶1、1∶2、1∶3、0∶1、2∶1、3∶1、1∶0等不同配伍规律，以1∶1苍术黄柏配伍样品供试品溶液为参照图谱，生成图3共有峰模式。

35苍术黄柏不同规律配伍非共有峰面积苍术黄柏不同配伍规律中非共有峰面积以3∶1配伍比例为最高为1062%，其次是1∶1配伍比例为806%。

4讨论

41流动相的选择本研究前期工作中通过对乙腈甲醇、四氢呋喃水、乙腈磷酸的HPLC严谨性进行考察，筛选出了乙腈磷酸系统流动相的分离效果较好，但在以乙腈磷酸不同的比例条件下等度洗脱的摸索中，发现乙腈磷酸水的条件下小檗碱和黄柏碱的分離度相对较好，根据查阅大量文献[68]发现采用梯度洗脱后，发现以乙腈水梯度洗脱，在55 min内将小檗碱和黄柏碱完全分离，基线噪声较低；为了进一步降低基线噪声，获得最好的共有峰形，本团队进一步对磷酸水的浓度进行了考察，分别用01%、02%、03%的磷酸水溶液进行比较，发现乙腈01%磷酸水溶液为流动相的分离效果最好，能够分离出最低基线噪声且峰形最好[912]。

42HPLC严谨性考察意义线性考查在某一个浓度或峰高（面积）情况下进行样品分析是否是准确的，而准确的概念就是要成线性，换句话说，在这个范围内，待测样品面积要与浓度成正比，即符合紫外检测器的朗伯比尔定律因为只有这样，在这个范围内浓度与面积成正比，分析结果才是准确的[1315]。而加样回收率包括绝对回收率和相对回收率，本研究涉及的是相对回收率。相对回收率严格来说有2种，一种是回收试验法，一种是加样回收试验法[16]。而本研究的目的主要是为了考察HPLC的严谨性，因此选用加样回收试验法，也就是是在已知浓度样品中加入药物，来和标准曲线比，标准曲线也是在基质中加药物。

43苍术黄柏配伍规律对药效物质的影响本实验结果发现，配伍前后指纹图谱在保留时间方面变化不大，RSD均小于3%；在此测定条件下，峰的个数无明显差异，说明黄柏配伍苍术之后可能没有新成分产生；相似性评价在黄柏、苍术不同配伍比例水煎液HPLC指纹图谱的重叠图中，以小檗碱为参照峰，可以确定10个共有峰。由苍术和黄柏二药配伍后品共有峰面积的变化可以看出，配伍之后化学成分的含量存在变化，其平均RSD值为1787%。并且可以看出其生物碱的含量随苍术质量的增加而减少，黄柏、苍术3∶1的配伍比例中，小檗碱的含量最大。其他峰形也随配伍剂量的改变也有所变化，提示该配伍比例对小檗碱的影响最小，临床组方中发挥的黄柏作用药效就较好；从而说明中药配伍和药物剂量对于充分发挥药物疗效至关重要。

参考文献

[1]中药复方配伍研究现状与思考[J].中草药，2009，40（12）：19982000.

[2]张宇燕，盖玉权，何昱，等.基于结构方程模型的中药复方配伍机制研究[J].中华中医药杂志，2012，27（6）：17021705.

[3]麦蓝尹，李怡萱，陈勇，等.基于数理统计方法学的中药复方配伍研究进展[J].中国中药杂志，2014，39（10）：17491756.

[4]熊延熙，丁舸.试论二妙散组方配伍意义[J].江西中医药，2016，47（2）：1516.

[5]郭建平，李国栋，赵彤英，等.HPLC对人血浆中葛根素及葛根黄酮的线性考察[J].药学实践杂志，2003，21（4）：219221.

[6]何佳佳，廉莲.HPLC同时测定关黄柏中多组分化学成分含量的方法研究[J].辽宁科技学院学报，2015，17（4）：3335.

[7]李红玲，莫炫永.HPLC法同时测定川黄柏中盐酸黄柏碱和盐酸小檗碱的含量[J].中国药房，2014，25（27）：25622564.

[8]朱志明，赖潇潇，苏慕霞.不同产地黄柏及关黄柏有效成分的含量测定[J].临床医学工程，2011，18（1）：106108.

[9]傅春升，王琰，李玥，等.黄柏苍术药对不同比例配伍中生物碱含量的变化[J].中国药房，2013，24（27）：25492551.

[10]李红英，向极钎，龙澜，等.HPLC法测定恩施黄柏药材中黄柏碱与小檗碱的含量[J].湖北民族学院学报：自然科学版，2013，31（1）：101103.

[11]李巧如，张鹏，陈世虎，等.黄柏与甘草及桑寄生共煎对小檗碱提取率影响的研究[J].中国药房，2005，16（3）：235236.

[12]周敬，于天浩，陈平，等.HPLC法测定黄柏提取液中盐酸小檗碱含量[J].江西中医药，2013，18（4）：6364.

[13]叶雪兰，高英，李卫民，等.HPLCUVELSD同时测定知母黄柏药对提取物中盐酸小檗碱、黄柏碱、知母皂苷BⅡ[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（8）：122124.

[14]张莉，潘超.高效液相色谱法同时测定二妙丸中盐酸小檗碱和黄柏碱的含量[J].中国新药杂志，2011，20（22）：22622264.

[15]赵伟杰，李伟，张晶.超声辅助川黄柏中黄柏碱的提取与含量测定的研究[J].化學工程师，2016，42（4）：2426.

[16]欧咏，吴娟，谢荷，等.黄柏生物碱膝关节微透析探针回收率的测定[J].沈阳药科大学学报，2014，31（9）：697705.

（2017-06-07收稿责任编辑：杨觉雄）