转桃PpCuZnSOD基因大豆的耐旱性

杨艳丽 杨勇 李大红 李鸿雁

摘要：为探索桃（Prun，us persica L.）铜/锌超氧化物歧化酶基因（PpCuZnSOD）在植物抗干旱胁迫中的作用，应用农杆菌介导法，将PpCuZnSOD基因转入大豆品种中黄13中。Southern印迹分析证实PpCuZnSOD基因已整合到大豆基因组中。定量PCR分析结果表明，转基因大豆中PpCuZnSOD表达水平均明显增加。用150/0 PEG4OOO模拟干旱胁迫时，转基因大豆种子萌发率与主根长显著高于非转基因大豆。在干旱10 d条件下，转基因大豆与非转基因大豆相比，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性增加，而丙二醛（MDA）含量下降，叶绿素含量降低较少。活性氧（ROS）染色结果显示，转基因植株在干旱胁迫下活性氧少于非转基因植株。复水后4d，转基因大豆的成活率显著高于非转基因大豆。这些结果表明，PpCuZnSOD能提高大豆的耐旱性。

关键词：转基因;耐旱性;大豆;Pp CuZn，SOD基因

中图分类号：S565.103.53

文献标识码：A

文章编号： 1000-4440（ 2018）05-0978-06

寒冷、干旱、涝害等环境胁迫可产生有毒自由基，危害农作物生产。活性氧（ROS）对细胞具有潜在的毒性，通过氧化脂质、核酸和蛋白质而破坏正常的新陈代谢。一些研究结果表明，ROS少量存在时，可以作为重要的信号分子发挥作用，参与控制病原体防御、激素信号传导、应激反应和植物生长发育等过程。然而，当活性氧产生量增加时，它们能够损伤甚至杀死植物细胞。但是，植物已经进化出一些防御机制来减轻不利环境条件造成的损害。例如，一些ROS清除酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化还原酶（PRXR），可以清除超氧阴离子（02-）等氧化物，从而保护植物免受环境胁迫。

超氧化物歧化酶（SOD）是参与ROS降解的第一个酶，能把超氧阴离子转换成H202。SOD有几种异构体，异构体类别取决于活性位点上的金属辅因子，例如，锰超氧化物歧化酶（MnSOD）、铜/锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）、铁超氧化物歧化酶（FeSOD）和镍超氧化物歧化酶（NiSOD）等。CuZnSOD是细胞质、细胞核和线粒体膜间隙中的主要自由基清除劑。在胁迫状态下，SOD活性和其转录表达水平增高。有研究结果表明，在干旱和盐胁迫下玉米和番茄中MnSOD和CuZnSOD高水平表达，这些有较高活性抗氧化酶的植物更耐盐、干旱或氧化胁迫，高盐和干旱胁迫能够改变抗氧化酶水平，在很大程度上提高幼苗的抗逆性。逆境条件下，水稻盐敏感品种SOD水平显著高于耐盐品种。过表达水稻叶绿体OsCu/ZnSOD基因的转基因株系在NaCl和NaHCO，胁迫下发芽率显著高于非转基因株系。也有研究结果表明在烟草叶绿体中增强锌超氧化物歧化酶的表达后叶绿体对甲基紫精铜（MV）的耐受性也增强。在转基因马铃薯和拟南芥上也有相似的现象。因而，盐胁迫和干旱胁迫下植物SOD活性的增加是缓解逆境损伤的一个步骤。

大豆是一种重要的农业作物，为人类主要植物蛋白质来源和植物油来源。在环境胁迫下，大豆往往在其细胞中积累活性氧，影响其生长发育和产量。Guttikonda等把拟南芥DREBID转录因子导人大豆中，在缺水时，与对照相比，转基因植株能保持较高的相对含水量，而且存活率显著高于非转基因植株。此外，与非转基因植株相比，转基因植株还保持了17%～24%的叶片细胞膜稳定性，说明耐旱性增强。李大红等将苜蓿（Medicago sativa）DREB1基因导人大豆，获得rd29A和CaMV-35S 2类启动子驱动的Ms DREB1转基因大豆，在严重干旱胁迫下，这2种启动子转基因株系均有一定耐旱能力。秦迪等发现在干旱条件下，8个转菠菜BADH基因大豆株系叶片中BADH基因表达量较高，转基因大豆发芽指数高于非转基因大豆，在8个转基因大豆材料中有7个增产。魏崃等利用农杆菌介导法获得过表达AtCBF4基因和过表达Bo WS基因的大豆株系，这2个株系均有很强的耐旱性。本研究将桃PpCuZn，SOD基因通过农杆菌介导法导人大豆基因组中，在干旱胁迫条件下检测转基因大豆苗期的耐旱性及其相关生理指标，以期获得具有一定应用价值的耐旱大豆新种质，为筛选具有育种应用价值的材料奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料和菌株

大豆品种中黄13号由驻马店农业科学院提供。大肠杆菌DH5a和根癌农杆菌EHA105菌株均由本实验室保存。

1.2 质粒载体和试剂

克隆载体pMD-18和DNA聚合酶购自于TaKa-Ra（中国大连）有限公司，pCAMBIA1301为本实验保存。TRIzol试剂购自Sigma公司，其他试剂为进口或国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 质粒构建与转化 根据GenBank中桃基因序列（XP-021817567）设计引物Pl（5-CG-GATCCATGGTGAAAGGCGTTGCTGTTC-3'） 和 P2（5'- CGAGCTCTCAGTTTTGGAGACCAATAATA-3'），T划线为相应酶切位点。用TRIzol试剂提取RNA，按说明书方法逆转录cDNA第一链及双链DNA。PCR反应体系（25μl）为：12μl ddH20，lμI模板，10μlEx Taq Mix，上、下游引物各lμl。反应条件为：95℃预变性5min：95℃变性60s，53℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环;72℃延伸10 min。扩增所得片段连接到T载体上。送上海生工公司测序后，与GenBank序列进行同源性比对。将载有目的基因PpCuZnSOD序列的T载体和表达载体pCAMBIA1301分别用限制性核酸内切酶BamH I、SacI双酶切（图1），1.2%琼脂糖电泳检测酶切结果。使用DNA回收试剂盒回收目的基因片段和表达载体片段.1.2%琼脂糖电泳检测回收效果，将目的基因片段50ng与载体17 ng加入到缓冲液中，加入T4连接酶lμl（10ng/μl），4℃过夜连接。转化后用PCR与双酶切检测质粒构建是否成功。用冻融法将表达载体转入农杆菌中。

1.3.2 转基因大豆株系的获得 大豆转化采用农杆菌介导的子叶节转化法。用50μg/ml潮霉素筛选抗性转基因植株。抗性转基因大豆植株经练苗后进行盆栽。

1.3.3 转基因大豆Southem blot检测参照Murraym等的CTAB法提取大豆基因组DNA。PpCuZn，SOD基因PCR分析：引物为P3（5-GAATCATCAACT-TCACCCAG-3'）、 P4 （5-CCAATAATACCACAAG-CAAC-3'），模板为大豆基因组DNA，复性温度为55℃，反应条件同方法1.3.1。用EcoR I内切酶在37℃下酶解大豆基因组DNA。以地高辛随机标记的PpCuZnSOD基因全长作为探针进行Southem杂交检测，具体方法参照德国罗氏地高辛说明书（DIG DNALabeling and Detection Kit，Roche）进行。

1.3.4 转基因植株mRNA RT-qPCR检测 对阳性植株的PpCuZn，SOD基因表达量进行分析。用TR-Izol试剂提取转基因大豆叶片RNA.用紫外分光度计测定260 nm吸光度与280 nm吸光度比值，计算RNA浓度。参照SMART cDNA synthesis Kit说明书合成cDNA第一链。在ABI 7500实时检测系统上进行qRT-PCR检测，试剂为Power Sybr Green PCR试剂（ABI）。荧光定量PCR引物为P5（5- GAAT-CATCAACTTCACCCAGGA-3'）和P6 （5-CCAATA-ATACCACAAGCAACCC-3'）。Actin，基因作为内参，上游引物为5'-TGATGGTGTGAGTCACACTGTACC-3，下游引物为5-GGACAATGGATGGGCCAGACTC-3。反应体系参照文献。所有PCR进行3个重复，并用同一个条件进行测试。采用两步法PCR扩增标准程序：50℃下2min，95℃下预变性10min;95℃下15s，60℃下45s，循环40次。基因拷贝数的定量采用双标准曲线法。

1.3.5 转基因大豆耐旱性分析 将检验正确的转基因和野生型（对照）大豆种子进行萌发试验，分别将转基因大豆与对照用15% PEG4000处理，7d后，记录主根长及种子萌发率。另外对转基因与对照大豆进行缺水试验。将发芽20 d的转基因与对照大豆苗移到含有砂与土（质量比1：1）基质中栽培7d。然后进行缺水胁迫处理，10 d后，测定其在干旱胁迫下相关生理指标变化。SOD活性测定采用NBT（四唑氮蓝）还原法，叶绿素含量测定采用分光光度法，POD活性测定采用比色法.MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法，CAT活性测定采用紫外吸收法，具体方法均参照文献。02和H，O，检测分别用NBT和DAB（3，3-二氨基联苯胺）进行染色，参照Yan等方法进行。然后复水4d，计算其存活率。每组每个株系6株。

1.4 数据分析

试验数据分析使用Excel 2013及SPSS17.0。

2 结果与分析

2.1 转基因植株分子检测

通过子叶节转化再生途径获得6个大豆转基因株系。用特异引物对再生苗进行PCR检测，均为阳性植株。为了进一步确认转基因植株，对这6个转基因株系进行Southern blot检测。以PpCuZnSOD基因的全长作为探针，对转基因株系进行Southem杂交验证，结果显示6个转基因株系均有1个拷贝的PpCuZnSOD基因整合到大豆基因组中（图2）。

2.2 转基因大豆株系PpCuZnSOD表达量分析

为了检测目的基因的表达效果，对6个转基因株系PCR及Southem blot阳性苗进行qRT-PCR检测。结果显示转PpCuZnSOD株系目的基因均能表达，但基因表达量存在较大差异。其中L2、L5株系PpCuZnSOD为过表达，其他株系表达较弱，而野生型植株基本没有表达。由此可见，PpCuZnSOD基因已经转到大豆基因组中，且有2个株系表达量较高（图3）。

2.3 转基因大豆耐旱性分析

对经过检测的转基因大豆及对照种子用15%PEG4000进行模拟干旱处理。7d后，转基因大豆种子的萌发率和主根长都显著高于对照（图4）。对盆栽27 d转基因植株与对照进行缺水胁迫处理10d，结果显示转基因大豆长势明显好于对照，叶绿素含量显著高于对照：复水后，转基因植株的成活率显著高于对照（图4、图5）。

为了比较大豆转基因植株和野生型植株的耐旱性，将27日龄的盆栽转基因植株进行干旱胁迫处理，处理10 d后测定转基因大豆各株系SOD、POD和CAT活性及丙二醛含量。结果（图6）表明，各株系与对照差异显著。干旱胁迫条件下，PpCuZnSOD的过表达植株MDA含量显著低于对照，而POD、SOD及CAT活性显著高于对照。说明PpCuZnSOD过表达导致转基因植株耐旱性提高。

为了进一步检测转基因大豆的耐旱性，对转基因大豆与对照的ROS进行检测，分别用NBT和DAB进行染色。结果（图7）显示，干旱胁迫后，过表达大豆植株叶片颜色明显浅于对照植株，表明过表达植株中02和H202的积累明显低于对照植株。说明干旱胁迫下过表达Pp CuZn，SOD基因可增强大豆细胞内活性氧清除能力，使02和H202的积累减少，从而减少细胞受损或细胞死亡，增强植物的耐旱性。

3 讨论

干旱是世界范围内日益严重的农业问题。干旱严重影响作物产量和品质。通过常规育种方法也能增加大豆的耐旱性，但费力费时，而且遗传多样性限制了改进的潜力。分子生物学方法有助于提高作物的耐旱性。许多研究结果表明，导人外源基因能增加植物的耐旱性。Kudo等发现过量表达OSPIL1和DREBIA的转基因拟南芥植株表现出较高的耐旱性。Hui等将CuZnSOD和APX基因转入甘薯，提高了甘薯的耐盐性。本研究将PpCuZnSOD基因转入大豆品种中黄13中，在干旱胁迫下转基因植株根系主根长度明显大于非转基因对照，耐旱性增强。

植物在干旱胁迫下能产生活性氧（ROS），危害植物生长发育。SOD通过催化O2歧化反应，将其还原为H202，然后，APX将过氧化氢氧化为水和氧。我们发现转基因大豆中SOD和APX活性均较高。表明转基因植株清除ROS的能力显著高于对照。转基因植物具有较强耐旱表型，例如在干旱胁迫下具有较低的叶绿素损失和脂质过氧化。转基因植株中CAT、SOD和POD活性的升高降低了干旱胁迫引起的ROS毒性。此外，DAB、NBT染色结果也表明转PpCuZnSOD基因大豆过氧化氢和超氧阴离子少于非转基因植株。

SOD在植物对不同类型胁迫的响应中起着重要作用。PpCuZnSOD是一种明显响应干旱胁迫的SOD，异源过表达可以增强大豆的耐旱性，表明PpCuZnSOD基因在植物响应干旱胁迫过程中发挥着一定作用，这对以后定向培育抗旱优良品种具有参考价值。