核桃茎段组织培养无菌芽苗的诱导

胡文斌 张少飞 孙娜 宫峥嵘

摘要：以改良DKW培养基为基本培养基，附加不同质量浓度的6-BA和IBA，对核桃进行茎段组织培养初代培养基筛选，同时进行继代培养，诱导无菌芽苗。结果表明：使用75%乙醇消毒60 s，再用0.1%氯化汞消毒8 min，可以达到最佳灭菌效果；最佳初代培养基为改良DKW培养基+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，继代培养芽苗生长良好。

关键词：核桃组培；快繁；污染；褐化

中图分类号：S664.1 文献标志码：A 文章编号：1001-1463（2018）05-0036-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.05.012

A Preliminary Report on Introduction Test of 12 New Oil Flax Strains

in the Dry Farming Area of Southern Ningnan

ZHANG Wei， LU Junwu， CAO Xiuxia， QIAN Aiping， YAN Kuanjiang

（Guyuan branch of Ningxia Academy of agricultural and Forestry Sciences， Guyuan Ningxia 756000， China）

Abstract：A introduction test of 12 new oil flax strains was carried out in the dry drilling cultivation conditions of the mountainous areas of Southern Ningxia. The results show that the seed yield of the new oil flax strain 09025 was 2 384.66 kg/hm2， 308.20 kg/hm2， 14.84% higher than of the local strains Ningya17， it is the first in all the tested strains， which increase in production was extremely significant. Its comprehensive traits are excellent； plant height is suitable； drought resistance stand out； the plants grow well；degree of uniformity is outstanding. Expression of Comprehensive Characters of the new oil flax strains 090252， and it is suitable to be grown in the dry land in the southern mountainous areas of Ningxia.

Key words：Oil flax（Linum usitatissimum L）；Strain；Ningnan mountainous areas；Dryland Area；Introduction

核桃（Juglans regia .L）古稱胡桃或羌桃，属胡桃科胡桃属，与榛子、板栗、腰果并称为世界四大干果[1 ]。核桃含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素及矿物质，营养丰富，具有多种保健及药用价值[2 - 3 ]。核桃为我国重要经济栽培树种，但目前主要是以实生苗嫁接的方式进行繁殖，需要大量的接穗，且切口处易发生氧化褐变，成活率很低、周期长且不稳定，易受天气影响。扦插繁殖基本不能成活，使得良种的繁殖效率极其低下[4 ]。

植物组织培养快繁技术，以繁殖系数高、速度快、育种时间短等优点，成为目前植物育苗的研究热点之一，具有很高的商业价值[5 ]。我们以陇南地区最为常见的核桃品种辽核1号为材料，研究了其茎段组织培养的最佳消毒时间及初代培养的最佳培养基配比，并进行继代培养，诱导出无菌芽苗，以期为核桃快繁体系的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

指示核桃品种为辽核1号，2～4年生嫁接苗，采自成县植物观光园。取当年生枝条的休眠芽和嫩枝茎段进行离体培养。

1.2 试剂

6-卞氨基嘌呤（6-BA），由上海蓝季科技发展有限公司生产；3-吲哚丁酸（IBA），由中国医药上海化学试剂公司生产。

1.3 外植体消毒和接种方法

茎段于每年5 — 8月取材，一般在晴天早上9：00左右进行。先在流水下冲洗过夜，用软毛刷沾取肥皂液刷洗干净，再进行表面消毒处理。置于超净工作台上，剪成长2～3 cm的带芽茎段，用75%酒精消毒60 s，然后用无菌水冲洗2～3次，再用0.1%氯化汞溶液消毒。试验设氯化汞消毒时间6、8、10 min，共3个处理，每个处理20瓶，每瓶接种1个外植体。接种时先将已消毒的外植体用无菌水反复冲洗5次。在无菌条件下切去下部有褐化的伤口，将消毒过的材料正插于培养基上进行培养。

1.4 培养基及培养条件

以改良DKW培养基为基本培养基，附加6-BA，IBA、蔗糖30 g/L、琼脂粉 8 g/L，pH 5.8～ 6.0。培养条件：培养温度为（25±2） ℃，相对湿度为60%，光照时间12 h/d，光照度2 000～2 500 lx[6 ]。分别于7、14、21、28、35、42 d统计接种材料的污染率、褐化率，死亡率和成活率，以及污染的类型。

1.5 激素质量浓度确定

以改良DKW培养基为基本培养基，附加不同质量浓度的6-BA和IBA，将单芽茎段接种于培养基上，研究激素配比对核桃萌芽的影响。试验设附加6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L、6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L、6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L、6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.05 mg/L、6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L、6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，共6个处理，3次重复。接种30 d后，观察芽的分化、增殖与生长情况。

1.6 继代培养

腋芽生长至3 cm左右时在无菌环境中将其小心取下，接种于筛选出的生长状态最好的培养基中，进行增殖培养。

2 结果与分析

2.1 外植体最佳消毒时间的确定

由图1、图2可知，随着消毒时间的延长，外植体的污染率和褐化率在逐渐下降。但通过与图3进行比较分析可知，氯化汞消毒8 min时，萌芽情况最好，高于其他两个处理。综合分析可知，核桃外植体的消毒方法是采用75%乙醇消毒60 s，再用0.1%氯化汞消毒8 min。

2.2 初代培养基的确定

从表1、图4可以看出，经过28 d的培养，所有处理外植体生长状况良好，其中以6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L处理萌芽率最高，增殖效果最好。因此，最佳增殖培养基配方确定为改良DKW培养基+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L，pH 5.8。

2.3 继代培养状况

将萌发的腋芽小心剪下，转接于改良DKW培养基+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L中。经过42 d的培养，外植体生长状况良好（图5）。

3 结论与讨论

对辽核1号核桃茎段组织培养快繁的研究表明，用75%乙醇60 s，0.1%氯化汞消毒8 min为最佳消毒时间。选择改良DKW为基本培养基，最佳初代及继代培养基配比为：改良DKW培养基+ 6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L，pH 5.8。

核桃组培过程中污染的发生及组织的褐化是核桃组织培养过程中最常见的现象，也是核桃组织培养过程中的两大难题。这是由于微生物体积极其微小，难以肉眼观察，生活力强，容易传播，再加上操作者的操作手法、习惯不同，以及外植体本身生理状态和环境因素的影响，导致污染经常发生。褐化是外植体组织内酚类物质经多酚氧化酶氧化形成褐色的醌类物质的现象，褐化后的外植体由于醌类物质对其抑制而生长缓慢，甚至将导致外植体死亡[7 ]。目前，核桃组培可采用MS、DKW、WPM培养基等，但是DKW培养效果最好[8 ]。而污染和褐化始终是核桃组织培养过程中的两大顽疾，常用消毒剂氯化汞能有效控制污染，但处理时间过长会杀死植物组织，虽能降低污染率，但外植体的成活率也随之下降，且氯化汞为重金属物质，会对环境造成污染[9 ]。张燕 等[10 ]利用青霉素和多菌灵处理外植体进行抗污染研究，取得了很好的效果；苗玉青等[11 ]研究发现，在进行初代培养时，利用低温处理外植体后，适当的暗培养可以降低褐化程度。

我们经过120 d的试验研究，采用改良DKW培养基，进行初代培养，筛选出了最佳初代培养基配比，同时进行了继代培养，诱导出无菌芽苗，也對研究过程中出现的污染及褐化问题进行了很好的处理，培养过程中没有出现大面积的污染及褐化，具有统计学意义。下一步可进行组培苗生根培养、炼苗及驯化移栽等研究。

参考文献：

[1] 张毅萍. 世界及我国核桃生产概况和几个问题[J]. 林业科技与市场信息，2002（3）：52-55.

[2] 封斌奎. 核桃营养保健功能与加工技术研究进展[J]. 陕西林业科技，2015（1）：10-13.

[3] 王新平，孙慧英. 核桃的营养药用价值及加工利用[J]. 现代园艺，2017（2）：20.

[4] 杨海波，王 娟. 核桃外植体的组织培养[J]. 安徽农业科学，2011，39（28）：17156-17157.

[5] 于艳萍，侯立群. 核桃组织培养技术研究综述[J]. 山东林业科技，2012（5）：117-120.

[6] 杨美平. 辽宁1号核桃组织培养技术[J]. 河北果树，2014（4）：46.

[7] 张 燕，何 晖. 核桃组织培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制[J]. 安徽农业科学，2010，38（20）：10553-10556.

[8] 张小红，闵东红，康 冰，等. 核桃组织培养中外植体材料的初代培养研究[J]. 陕西林业科技，2005（2）：6-8.

[9] 伊书亮，郭国宁. 核桃组织培养研究综述[J]. 安徽农学通报，2009，15（11）：58-60.

[10] 张 燕. 核桃组培快繁技术的研究[D]. 晋中：山西农业大学，2004.

[11] 苗玉青，李 冠. 薄皮核桃组织培养与快速繁殖[J]. 新疆农业科学，2010，47（3）：503-507.

（本文责编：刘 赟）