表皮葡萄球菌临床菌株icaA、icaR基因与生物被膜形成关系的研究

朱娟　陈丽华　佘鹏飞　谭芮辰　王妍乐　伍勇

〔摘要〕 目的 研究表皮葡萄球菌icaA和icaR基因與生物被膜形成的相关性。方法 收集湘雅三医院机械通气患者分离表皮葡萄球菌26株，按生物被膜成膜能力分成生物被膜阳性菌组和生物被膜阴性菌组各13株。采用RT-PCR分别对2组细菌icaA和icaR基因灰度比进行检测；采用real-time PCR分别检测2组细菌icaA和icaR基因的表达，并通过2-△△Ct方法进行相对定量。结果 RT-PCR结果显示icaA基因在生物被膜阳性组中的灰度比为0.96～1.38，在生物被膜阴性组中为0.89～1.56，表达差异无统计学意义（T=10.65，P=0.057）；同理，icaR基因在生物被膜阳性组中的灰度比为0.79～1.24，在生物被膜阴性组中则为0.80～1.36，表达差异亦无统计学意义（T=14.62，P=0.479）。但icaA基因在生物被膜阳性组中的平均秩（16.35）明显高于生物被膜阴性菌组（10.65），而icaR基因生物被膜阳性组的平均秩（12.38）明显小于生物被膜阴性菌组（14.62）。real-time PCR检测发现表皮葡萄球菌生物被膜阳性组icaA基因的表达量（△CT=4.86）是生物被膜阴性组（△CT=13.57）的418.8倍（t=61.890，P<0.01），而icaR基因的表达量（△CT=19.03）仅为生物被膜阴性组（△CT=11.85）的1/145（t=21.330，P<0.01）。结论 icaA基因与表皮葡萄球菌生物被膜的形成呈正相关，而icaR基因与表皮葡萄球菌生物被膜的形成呈负相关。

〔关键词〕 表皮葡萄球菌；icaA；icaR；生物被膜

〔中图分类号〕R393；R378.1 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.003

〔Abstract〕 Objective To study the correlations between icaA and icaR genes with biofilm formation of Staphylococcus epidermidis （S. epidermidis）. Methods 26 strains of S. epidermidis isolated from tracheal catheter of patients with mechanical ventilation in ICU of the Third Xiangya Hospital were collected and divided into biofilm positive group （13 strains） and biofilm negative group （13 strains） according to biofilm formation ability. The gray scale ratios of icaA and icaR genes in two groups were determined by reverse transcription PCR. The expressions of icaA and icaR genes in two groups were detected by real time PCR， the relative quantification was measured by using 2-ΔΔCt method. Results The RT-PCR showed that the gray scale ratios of icaA in positive group and negative group of biofilm-forming were 0.96～1.38 and 0.89～1.56， respectively， the difference was not statistically significant （T=10.65， P=0.057）. The gray scale ratios of icaR genes in positive group and negative group of biofilm-forming were 0.79～1.24 and 0.80～1.36， respectively， the expression between the two groups were not statistically significant （T=14.62， P=0.479）. The mean rank and sum of ranks of icaA gene in biofilm positive bacteria group （16.35） were significantly higher than those in biofilm negative group （10.65）， but the mean rank and sum of ranks of icaR gene in biofilm positive bacteria group （12.38） were significantly lower than those in biofilm negative bacteria group （14.62）. Real-time PCR showed that the expression of icaA gene in S. epidermidis in biofilm positive group （△CT=4.86） was 418.8 times of that in biofilm negative bacteria group （△CT=13.57） （t=61.890， P<0.01）， while the expression of icaR gene in biofilm positive group （△CT=19.03） was only 1/145 of that in negative group （△CT=11.85） （t=21.330， P<0.01）. Conclusion icaA gene is positively related to the formation of biofilm in S. epidermidis， while icaR gene is negatively related to the formation of biofilm in S. epidermidis.

〔Keywords〕 Staphylococcus epidermidis； icaA； icaR； biofilm

表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis）是人体皮肤和黏膜正常菌群之一。近年来，随着各种体内置入设施，如气管插管、中心静脉置管和人工心脏瓣膜等的广泛使用，表皮葡萄球菌已成为医院内感染重要病原菌[1]。且随着抗生素的不合理使用，表皮葡萄球菌的耐药率有所增加[2]。此外，表皮葡萄球菌容易形成生物被膜，进而增强菌株耐药性并能使其逃避宿主免疫系统的监控，造成慢性、持续性和反复性感染特点[3]。研究发现表皮葡萄球菌生物被膜胞外基质的主要成分是胞间多糖粘附素（polysaccharide intercellular adhesion， PIA）[4]。PIA是ica操纵子编码产物，ica操纵子全长3.4 kb，包括icaR（调节基因）及串联存在的icaA、icaD、icaB和icaC基因[5]。icaR基因位于ica操纵子的上游，编码合成的icaR可与icaA基因的起始密码子相结合调控ica操纵子的表达[6]。本文通过分析表皮葡萄球菌临床菌株icaA、icaR基因与生物被膜形成的关系，进一步了解表皮葡萄菌生物被膜形成的遗传学基础。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集湘雅三医院ICU病房机械通气患者气管内导管和痰液标本中分离出的表皮葡萄球菌单个菌落，于血琼脂平板上纯培养后筛选出的生物被膜阳性和生物被膜阴性表皮葡萄球菌各13株。菌株经Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定仪鉴定。生物被膜鉴定参照Freeman等的方法[7]进行，将收集的吸痰标本和装有气管导管的生理盐水旋涡振荡后，分别接种于刚果红平板（LB琼脂培养基中加入刚果红，浓度为0.8 g/L）， 37 ℃培养48 h后观察结果，菌落变为黑色为生物被膜阳性菌株，菌落红色为生物被膜阴性菌株，表皮葡萄球菌标准菌株ATCC RP62A和ATCC12228分别为成膜能力阳性和阴性质控菌株。

1.2 主要试剂及仪器

UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（上海生工公司）；cDNA逆转录试剂盒（Fermentas公司）；2×Tap PCR Master Mix、 Marker I DNA Ladder、Trans Start Green qPCR SuperMix UDG和Passive Reference DyeI/PCR Enhancer（北京全式金生物公司）；9700 GeneAmp PCR System（美国PE公司）；Gene Genius全自動凝胶成像系统（美国Syngene公司）；引物由上海生工公司合成。

1.3 细菌总RNA的提取

取0.5麦氏单位新鲜菌悬液2 μL至3 mL LB液体培养基中，37 ℃振荡培养16 h。总RNA的提取参照UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒的说明书进行。即在上述菌液中加入l μL 70%乙醇和100 μL溶菌酶，37 ℃ 45 min，再加入1 mL Trizol充分吹打混匀，置冰上15 min。加入氯仿萃取，收集上层水相至干净的EP管中，加入1/2倍体积无水乙醇沉淀，再经RPE溶液离心洗涤后，在吸附柱中央加入30 μL DEPC水收集RNA，并置-70 ℃保存[8]。

1.4 cDNA的合成及RT-PCR

根据Fermentas公司试剂盒说明书进行cDNA合成。cDNA合成反应体系为20 μL： Anchored Oligo（dT）18（0.5 μg/μL） 1 μL，2×ES Reaction Mix 10 μL，Easy Script RT/RI Enzyme Mix 1 μL，RNase-free Water 7 μL，RNA模板1 μL。反应条件为：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 30 min。RT-PCR反应体系为（共20 μL）：16S rRNA上、下游引物（20 μmol/L）各0.4 μL，模版1.6 μL， Taq Mixture 8 μL， ddH2O 9.6 μL。反应条件为：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 40 s， 55 ℃40 s， 72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 10 min[9]。逆转录icaA、icaR和16S rDNA的特异性引物序列通过软件Primer Premier 6.0设计，如表1。

其中，16S-rRNA为内参基因。扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳并成像，并用灰度比来进行对比分析，即：各目的基因灰度与16S-rRNA灰度的比值，由image J软件进行计算，实验重复3次。

1.5 icaA和icaR基因表达量检测

real-time PCR反应体系为25 μL：2×Trans Start Green qPCR SuperMix UDG 12.5 μL，Passive Reference Dye/PCR Enhancer 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，MgCl2 0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s， 55 ℃ 15 s， 72 ℃ 10 s，45个循环。最后，设置溶解曲线程序：95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，实验重复3次[10]。采用2-△△Ct方法进行icaA和icaR基因相对表达量的计算。其中，△△Ct=实验组（目的基因Ct-内参基因Ct）-对照组（目的基因Ct-内参基因Ct）[11]。

1.6 统计学分析

偏态分布资料采用秩和检验，统计量为平均秩T。正态分布资料组间采用SPSS 19.0软件进行独立样本的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 結果

2.1 RT-PCR检测icaA和icaR基因的表达差异

icaA基因在生物被膜阳性组中的灰度比为1.17±0.28，在生物被膜阴性组中则为1.23±0.19，表达差异无统计学意义（T=10.65，P=0.057）；同理，icaR基因在生物被膜阳性组中的灰度比为（1.02±0.16），在生物被膜阴性组中则为（1.08±0.20），表达差异亦无统计学意义（T=14.62，P=0.479）。但icaA基因生物被膜阳性菌组平均秩（16.35）及秩和（212.5）明显高于阴性菌组平均秩（10.65）及秩和（138.5）；而icaR基因生物被膜阳性菌组平均秩（12.38）及秩和（161.0）明显低于阴性菌组平均秩（14.62）及秩和（190.0），见图1。

2.2 real-time PCR结果

icaA和icaR与16S rDNA基因的熔解曲线的熔点峰窄且尖，表明PCR产物较纯，没有非特异性产物和引物二聚体，各目的基因引物特异性好，见图2。生物被膜阳性表皮葡萄球菌icaA基因转录水平（△CT=4.86）显著超过了生物被膜阴性组（△CT=13.57），是阴性菌组的（418.8±21.34）倍（t=61.890，P<0.01），而icaR基因在表皮葡萄球菌生物被膜阴性菌组（△CT=11.85）中的转录水平是阳性菌组（△CT=19.03）的（145.0±10.21）倍（t=21.330，P<0.01）。

3 讨论

结果显示，icaA基因在生物被膜阳性菌组中转录水平显著高于阴性菌组，是阴性菌组的418.8倍；而icaR在生物被膜阳性菌组中表达量却远远低于阴性菌组，仅为阴性菌组的1/145。表明表皮葡萄球菌icaA基因与其生物被膜的形成呈正相关，而icaR基因与表皮葡萄球菌生物被膜的形成呈负相关。

于树云等[12]发现，某些表皮葡萄球菌临床株具有形成生物被膜的能力，而且与icaA基因的存在及正常表达有关。而王勇翔等[13]对19例表皮葡萄球菌临床分离株通过半定量粘附实验、扫描电子显微镜法和光学显微镜等方法检测发现，表皮葡萄球菌ica操纵子的转录水平与生物被膜形成密切相关。与本文研究结论一致。

RT-PCR受干扰的因素颇多，对于相对定量还存在一定的不足，RNA的降解等原因对结果的影响较大[14]，但real-time PCR可以为测定基因转录水平研究提供准确可靠的信息[15]。本研究通过RT-PCR检测结果显示icaA和icaR两种基因的灰度比值差异不显著，但随后本研究采用了real-time PCR进一步核实，real-time PCR结果表明，生物被膜阳性表皮葡萄球菌的icaR表达水平低，而icaA表达水平高；生物被膜阴性表皮葡萄球菌的icaR表达水平相对较高，而icaA表达水平低。本文菌株数量偏少，需增大菌株量对icaA和icaR基因调节表皮葡萄球菌生物被膜的形成进一步研究，以便为治疗表皮葡萄球菌生物膜药物的研究提供有力的理论基础。

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（本文編辑 杨 瑛）