肿瘤标志物PHPAA分子印迹聚合物的合成与性能研究

刘伟婷 张媛媛 乾康 高淑婷 万喜 尹小英

中圖分类号 O631.6；R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）08-1027-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.04

摘 要 目的：合成对羟基苯乙酸（PHPAA）分子印迹聚合物（MIPs），为肿瘤患者尿液中PHPAA的分离富集提供参考。方法：以PHPAA为模板分子，以偶氮二异丁腈为引发剂，分别以4-乙烯基吡啶（4-V）、丙烯酰胺（AM）、1-乙烯基咪唑（1-V）、邻苯二胺为功能单体，以二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）为交联剂，采用沉淀聚合法合成MIPs。采用扫描电镜、红外光谱、静态吸附试验、分子识别性能试验对其微球结构和性能进行表征。结果：MIPs1（4-V、EGDMA）微球粘连严重，MIPs2（AM、EGDMA）微球呈聚集状；MIPs3（1-V、TRIM）、MIPs4（邻苯二胺、TRIM）微球较为分散，且球形度好。MIPs的红外光谱中未见PHPAA的特征吸收峰。各MIPs的吸附量均高于不含模板分子的空白印迹聚合物，且随着模板分子浓度的升高，其吸附量也随之增加。MIPs3的吸附量显著高于其他MIPs，其对PHPAA的静态分配系数（0.14）高于其他结构类似物[对羟基苯丙酸（PHPA）（0.06）、酪氨酸（TA）（0.01）]，对PHPAA与PHPA、PHPAA与TA的选择性分离因子分别为2.3、11.5。结论：以1-V为功能单体、TRIM为交联剂合成的MIPs对PHPAA分子具有特异性吸附和选择性识别能力，可将其作为固相萃取剂，用以分离富集肿瘤患者尿液中低含量的PHPAA。

关键词 对羟基苯乙酸；分子印迹聚合物；功能单体；沉淀聚合；静态吸附；分子识别性能

ABSTRACT OBJECTIVE： To synthesize 4-hydroxyphenylacetic acid （PHPAA） molecular imprinted polymers （MIPs）， and to provide reference for separation and enrichment of PHPAA in urine of cancer patients. METHODS： With PHPAA as template molecule and azobisisobutyronitrile as evocating agent， MIPs was synthesized by precipitation polymerization using 4-vinyl pyridine （4-V）， acrylamide （AM）， 1-vinyl imidazole （1-V） and o-diaminobenzene as functional monomers， ethylene glycol dimethacrylate （EGDMA） and trimethylolpropane trimethacrylate （TRIM） as crosslinking agent. Using scanning electron microscope， infrared spectrum， static adsorption test and molecular recognition performance test used adopted to characterize the structure and performance of MIPs. RESULTS： MIPs1（4-V， EGDMA）microspheres adhered seriously， and MIPs2（AM， EGDMA）microspheres are aggregated. MIPs3（1-V， TRIM）， MIPs4 （o-diaminobenzene， TRIM） microspheresare were dispersed and had good sphericity. Characteristic absorption peak of PHPAA was not found in infrared spectrum of MIPs. The adsorption capacity of each MIPs was higher than that of blank imprinted polymer without the template molecule， and increased as the increase of template molecular concentration. The adsorption capacity of MIPs3 was significantly higher than that of other MIPs， and its static distribution coefficient （0.14） of PHPAA was higher than that of other structural analogues [PHPA （0.06），TA （0.01）]， selective separation factors of PHPAA to PHPA， PHPAA to TA were 2.3， 11.5， respectively. CONCLUSIONS： MIPs synthesized with 1-V as functional monomer and TRIM as crosslinking agent has the ability of specific adsorption and selective recognition. It can used as solid phase extractant to separate and enrich low content of PHPAA in the urine of tumor patients.

KEYWORDS 4-Hydroxyphenylacetic acid； Molecular imprinted polymer； Functional monomer； Precipitation polymerization； Static adsorption； Molecular recognition performance

对羟基苯乙酸（4-Hydroxyphenylacetic acid，PHPAA）是酪氨酸代谢产物之一[1]。经研究发现，酪氨酸及其酚类代谢产物的紊乱不仅与氨基酸代谢疾病有关，而且与恶性肿瘤也有一定关联[2-3]。代谢研究结果表明，乳腺癌和卵巢癌患者尿液中PHPAA的含量低于正常人[（5.39±0.23）～（99.67±1.82）mg/L]，加之尿液中成分复杂，传统的萃取填料（C8、C18等）难以特异性地将其提取出来，使得肿瘤标志物的分离富集成为难题[4-5]。近年来，分子印迹聚合物（Molecular imprinted polymers，MIPs）由于其识别能力强、性质稳定、可重复使用等优点广泛应用于仿生传感器[6]、分离分析[7]和人工模拟抗体[8-9]等领域，非常适合作为固相微萃取填料，分离富集生物样本中微量的目标产物，实现特定分子的分离与分析。为此，本研究运用沉淀聚合法合成MIPs，并对其结构和吸附、分子识别性能进行表征，以期为肿瘤患者尿液中低含量PHPAA的分离富集以及早期诊断、辅助治疗提供参考。

1 材料

1.1 仪器

UV-2550型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；5700型红外光谱仪（美国Nicolet公司）；Quanta 250型扫描电子显微镜（美国FEI公司）；CHY-2型恒温振荡器（江苏金坛富华仪器有限公司）；SK-1200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；HH-2型恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。

1.2 试剂

PHPAA对照品（批号：J1409049，纯度：99%）、对羟基苯丙酸对照品（PHPA，批号：G1513061，纯度：98%）、酪氨酸对照品（TA，批号：A0274948，纯度：98%）均购自上海阿拉丁试剂有限公司；功能单体[4-乙烯基吡啶（4-V）、丙烯酰胺（AM）、1-乙烯基咪唑（1-V）、邻苯二胺]、交联剂[二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）]、引发剂[偶氮二异丁腈（AIBN）]、致孔剂（乙腈）等试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 合成

采用沉淀聚合法。将模板分子（PHPAA）、功能单体（4-V、AM、1-V、邻苯二胺）和交联剂（EGDMA、TRIM）溶解在装有致孔剂（乙腈）80 mL的圆底烧瓶中，加入引发剂（AIBN）78 mg后，通氮气15 min，密封，放置于60 ℃水浴中聚合24 h。采用索氏提取法，使用甲醇-冰醋酸溶液（9 ∶ 1，V/V）对反应后的聚合物进行洗脱，以去除模板分子（吸取洗脱液适量，在277 nm波长处进行紫外光谱扫描，至检测不到模板分子的吸收为止）；再用甲醇洗去残留的冰醋酸，即得到MIPs，将该聚合物于60 ℃真空烘干，备用。空白印迹聚合物（Nonimprinted polymers，NIPs）除不加入模板分子外，其余步骤同上。不同MIPs、NIPs的组成见表1。

2.2 扫描电镜分析

分别取“2.1”项下各MIPs、NIPs适量，置于试管中，加入适量甲醇，超声（功率：53 kHz）处理10 min使其分散，随后于60 ℃真空烘干，使用扫描电子显微镜对其微球形貌进行结构分析。

2.3 红外光谱分析

使用红外光谱仪对模板分子、MIPs、NIPs进行比较，分析其结构变化。

2.4 静态吸附试验

2.4.1 PHPAA标准溶液的制备 精密称取PHPAA对照品0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g，分别置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容，搖匀，得相应质量浓度的PHPAA对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各0.25 mL，分别置于25 mL量瓶中，加乙腈稀释并定容，摇匀，得质量浓度分别为10、20、30、40、50、60 μg/mL的PHPAA标准溶液，备用。

2.4.2 试验内容 精密称取“2.1”项下各MIPs/NIPs 20.0 mg，置于10 mL量瓶中，依次加入“2.4.1”项下PHPAA标准溶液各3 mL，密闭，于25 ℃恒温振摇吸附12 h后，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液适量，使用紫外-可见分光光度计于277 nm处测定其吸光度，考察模板分子的浓度变化，并以此计算模板分子在聚合物上的吸附量（Q）。Q=（c0-cs）V/m[式中，Q为静态平衡吸附量（μmol/g），c0为模板分子的起始浓度（μmol/L），cs为吸附平衡时模板分子的浓度（μmol/L），V为底物溶液的体积（L），m为MIPs/NIPs的使用量（g）][10]。以Q为纵坐标、c0（不同浓度单位之间需相互换算）为横坐标绘制等温吸附曲线，考察MIPs的静态吸附性能。

2.5 分子识别性能试验

2.5.1 PHPA、TA标准溶液的制备 精密称取PHPA、TA对照品各0.01 g，按“2.4.1”项下方法操作，制得质量浓度均为10 mg/L的PHPA、TA标准溶液，备用。

2.5.2 试验内容 选取人体内酪氨酸代谢产物PHPAA、PHPA、TA作为底物，考察MIPs的分子识别性能[11]。精密称取“2.1”项下MIPs各20 mg，分别置于10 mL量瓶中，依次加入质量浓度为10 mg/L的PHPAA、PHPA、TA标准溶液各3 mL，于25 ℃恒温振荡24 h。取上述溶液适量，使用紫外-可见分光光度计分别于277 nm（PHPAA）、278 nm（PHPA）、279 nm（TA）处测定其吸光度，考察底物的浓度变化，并以此计算各底物在聚合物上的吸附量，平行测定3次。MIPs的分子识别性能以静态分配系数（Kd）和选择性分离因子（α）进行表征。其中，Kd=cp/cc[式中，cp表示聚合物结合底物的浓度（μmol/g），cc表示吸附平衡时底物在溶液中的浓度（μmol/L）]；Kd体现了MIPs对底物的吸附能力（Kd越大，表明MIPs对底物的吸附力能力越强）。α=Kdi/Kdj[式中，i和j分别表示模板分子（PHPAA）和其他底物（PHPA、TA）]；规定若j=i，α=1；若α<1，表明MIPs对其模板分子没有选择性；若α>1，则表明MIPs对模板分子有一定的选择性[12]。

3 结果

3.1 扫描电镜分析结果

不同MIPs的电镜图谱见图1，不同NIPs的电镜图谱见图2。由图1可见，MIPs1粒径较小（103～243 nm），微球粘连严重（图1A）；MIPs2呈聚集状，且其球形度较差（图1B）；MIPs3、MIPs4的球形度较好，微球光滑均匀，且较为分散（图1C、图1D），其中MIPs3粒径为350～810 nm，分布均匀，形状饱满（图1C）。由图2可见，各NIPs与对应MIPs的形态虽较为相似，但微球球体不规则、粘连严重、粒径略小。

3.2 红外光谱分析结果

由扫描电镜分析结果可见，MIPs3微球形态较好，故对模板分子、MIPs3、NIPs3进行红外光谱分析，结果见图3。由图3可见，PHPAA在3 264、1 707 cm-1处有强烈的吸收峰，分别来自PHPAA中—OH以及—COOH中C=O的特征吸收峰；在1 607、1 516 cm-1处的吸收峰则可作为其结构中苯环存在的依据。MIPs3在2 965 cm-1处的C—H伸缩振动吸收强度较大，由此可推测，模板分子与功能单体1-V发生了聚合反应；在1 737 cm-1处为TRIM中C=O的伸缩振动峰，说明交联剂已成功固定在MIPs结构中；同时其红外光谱显示，PHPAA的特征吸收峰已消失，表明PHPAA已被完全洗脱。将MIPs3与NIPs3的红外图谱进行比对，可见两者的特征吸收峰大致相同，无明显变动。

3.3 静态吸附试验结果

不同MIPs、NIPs的等温吸附曲线见图4。由图4可见，不同功能单体、交联剂合成的MIPs的Q均大于对应NIPs，且随着底物PHPAA浓度的增加，MIPs的Q也随之增加；同时，当底物浓度相同时，MIPs3的Q大于其他MIPs，表明以1-V为功能单体、TRIM为交联剂合成的MIPs3对PHPAA具有较高的特异性吸附性能。

3.4 分子识别性能试验结果

由静态吸附试验结果可知，MIPs3具有最好的吸附性能，且在底物PHPAA浓度为60 μg/mL时，其Q达到13.398 μmol/g，故本研究考察了MIPs3对各底物的分子识别性能，结果见表2。

由表2可知，MIPs3对PHPAA的Kd为0.14，高于其结构类似物PHPA的0.06和同为酪氨酸代谢产物TA的0.01；同时，MIPs对PHPAA与PHPA、PHPAA与TA的α分别高达2.3、11.5，表明MIPs对PHPAA的吸附具有选择性。

4 讨论

本研究采用沉淀聚合法，在乙腈溶液中，以4-V、AM、1-V、邻苯二胺为功能单体，EGDMA、TRIM为交联剂，于60 ℃水浴中合成MIPs。在前期预试验中，本课题组对功能单体、交联剂的组合方式以及反应条件进行了探讨。结果发现，以4-V为功能单体、TRIM为交联剂时，得到的聚合物并非为沉淀，故选用EGDMA为交联剂；当以1-V、邻苯二胺为功能单体，EGDMA为交联剂时，所得聚合物为絮状物，且在洗脱过程中溶解，故将交联剂替换为TRIM。同时，合成反应需在无氧条件下进行，否则无法获得MIPs。

电镜扫描结果显示，以EGDMA为交联剂合成的MIPs（MIPs1、MIPs2）微球粘连严重或呈聚集状；而以TRIM为交联剂合成的MIPs（MIPs3、MIPs4）微球则较为分散，且球形度好；其中，以1-V为功能单体的MIPs3微球粒径适当、分布均匀、形状饱满。这可能与PHPAA分子含有1个酚羟基和1个羧基，具有一定的酸性，碱性功能单体更有利于形成稳定的模板分子-功能单体复合物有关。红外图谱印证了模板分子与功能单体的聚合反应，且作用位点是PHPAA的—OH和—COOH（MIPs、NIPs的紅外图谱中，上述基团的特征峰消失）。

静态吸附性试验考察了MIPs对不同浓度底物的吸附能力。结果显示，MIPs对PHPAA的Q高于NIPs，提示MIPs对底物的吸附不同于NIPs的物理吸附，而是一种具有特异性识别位点的选择性吸附[13]。除此之外，3种不同功能单体合成的MIPs对模板分子的吸附能力有显著差异，Q由高到低排序依次为MIPs3>MIPs1>MIPs4>MIPs2，笔者分析原因可能为：（1）PHPAA与1-V之间存在氢键和π-π键的共同作用，因此具有较好的吸附效果；（2）相比于二元交联剂EGDMA，三元交联剂TRIM分子结构比前者多1个乙烯基，使得后者的MIPs更易保持结合位点的刚性，故吸附性能更强。

通过Kd和α对MIPs的分子识别性能进行评价，不仅反映了底物在固定相和流动相中的迁移能力，同时还印证了在干扰底物的存在下，MIPs对PHPAA的分离性能。结果显示，以1-V为功能单体合成的MIPs3对各底物的Kd由大到小排序依次为PHPAA>PHPA>TA，PHPAA与PHPA、PHPAA与TA的α均超过1，提示相比于PHPA、TA，MIPs对PHPAA的吸附具有特异性。笔者认为这种特异性识别能力可能与MIPs中留有与底物结合位点相匹配的空穴有关。

综上，以1-V为功能单体、TRIM为交联剂合成的MIPs具有特异性吸附性能，可选择性识别PHPAA分子，可将其作为固相萃取剂，用以分离富集肿瘤患者尿液中低含量的PHPAA，为其早期诊断和治疗提供参考。

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（收稿日期：2017-06-05 修回日期：2018-02-23）

（编辑：张元媛）