仙子益真胶囊对卵巢早衰小鼠外周血清性激素水平的影响

黄晋琰 林夏静 徐珉

〔摘要〕 目的 观察补肾填精中药仙子益真胶囊对卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）模型小鼠性激素调节作用，初步探讨仙子益真胶囊治疗卵巢早衰的可能机制。方法 选用动情周期规律的SPF级雌性C57BL/6J性小鼠随机分为空白对照组、造模组。造模组使用雷公藤多苷片造模成功后，再随机分为模型组，益真低、中、高剂量组和西药组，并予以相应干预。治疗结束后ELISA测定血清中雌二醇（estradiol，E2）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）及黄体生成素（luteinizing hormone，LH）的含量。結果 与空白对照组比较，模型组E2含量下降，FSH、LH含量升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，益真低剂量组、益真中剂量组、益真高剂量组、西药组E2含量上升，FSH、LH含量下降，差异有统计学意义（P<0.01）。结论 补肾填精中药仙子益真胶囊可以提高POF模型小鼠血清E2的含量，降低FSH、LH的含量，改善POF小鼠生殖内分泌环境。

〔关键词〕 卵巢早衰；仙子益真胶囊；中医药疗法；性激素

〔中图分类号〕R285.5；R711.75 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.08.006

〔Abstract〕 Objective To investigate the regulatory effect of Xianzi Yizhen Capsule， a Chinese patent drug for nourishing kidney-essence， on sex hormones in mice with premature ovarian failure（POF） and the possible mechanism of Xianzi Yizhen Capsule in the treatment of POF. Methods The specific pathogen-free female C57BL/6J mice with a regular estrous cycle were randomly divided into blank control group and model group. The mice in the model group were treated with Tripterygium wilfordii polyglycoside tablets to establish a mouse model of POF and were then randomly divided into model group， low-， middle-， and high-dose Yizhen groups， and Western medicine group， and corresponding treatment was given. After the treatment ended， ELISA was used to measure the serum level of estradiol （E2）， follicle-stimulating hormone （FSH）， and luteinizing hormone （LH）. Results Compared with the blank control group， the model group had a significant reduction in E2 and significant increases in FSH and LH （P<0.01）. Compared with the model group， the low-， middle-， and high-dose Yizhen groups and the Western medicine group had a significant increase in E2 and significant reductions in FSH and LH （P<0.01）. Conclusion In mice with POF， the kidney essence-nourishing traditional Chinese medicine Xianzi Yizhen Capsule can improve the serum level of E2， reduce the serum levels of FSH and LH， and improve reproductive endocrine environment.

〔Keywords〕 premature ovarian failure； Xianzi Yizhen Capsule； traditional Chinese medicine treatment； sex hormone

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40岁以前发生的排卵和卵巢分泌激素功能的紊乱和停止，出现卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）和黄体生成素（luteinizing hormone，LH）升高，而雌二醇（estradiol，E2）降低，临床主要表现为继发性闭经、绝经、不孕，可能伴有围绝经期症状，如潮热、出汗、烦躁以及骨质疏松等。本病的发病率呈逐年上升且有低龄化趋势[1]。据统计，本病在40岁之前的发病率为1%～2%，在30岁之前的发病率为0.1%[2]，在20岁以前发病率为0.01%[3]。对于卵巢早衰，古代医学无此病名，根据临床症状属“月经过少”“血枯”“血隔”“闭经”“月水先闭”“经水早断”等范畴。古今医家对POF病因病机的认识并不统一，但大抵认为肾虚为该病的关键，且与心、肝、脾有关，故各医家对POF的治疗多从补肾着手[4-5]。

补肾填精中药制剂仙子益真胶囊为广东省名中医李丽芸教授经验方，由熟地黄、女贞子、旱莲草、川断、菟丝子、淫羊藿组成，有滋肾养阴、益精养血之功，在治疗月经失调、不孕不育等疾病中有较好的临床疗效。既往研究显示，补肾中药周期疗法可促进肾中阴阳平衡及其协调转化，达到健全黄体功能以助孕的目的[6]；给予补肾填精中药益真胶囊治疗后，通过观察围排卵期经阴道多普勒超声下卵子大小、形态及卵巢间质血流的变化，提示可改善高龄不孕妇女围排卵期卵巢间质血流，加快卵泡生长，减少小卵泡排卵，具有改善卵子质量、提高卵巢储备的作用[7]。

为了进一步阐述补肾填精中药仙子益真胶囊治疗卵巢早衰的作用，本实验通过雷公藤多苷片建立卵巢早衰小鼠模型，观察仙子益真胶囊对小鼠外周血清性激素水平的影响，为临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雌性C57BL/6J小鼠42只，体质量（21.24±0.93） g，由广东省中医院科研动物实验中心提供，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0011，动物合格证号为11400700203531。所有小鼠均经阴道脱落细胞涂片筛查动情周期正常。清洁环境饲养，恒温（24 ℃）、恒湿（60%）、自然昼夜节律光照，给予足够的水和食物，通风良好。

1.1.2 药物与试剂 所有实验药物均购自广东省中医院药房。雷公藤多苷片，远大医药黄石飞云制药有限公司出品，规格为10 mg/片（批号20161001）。仙子益真胶囊为广东省中医院院内制剂（批号160904），其主要成分为熟地黄、女贞子、旱莲草、川断等。由院内制剂室按上述药物组成分别选料，经过清洁、干燥、粉碎、消毒、浸泡、提取、制粒，粉碎装胶囊，每粒重0.5 g，约含生药量1.65 g。补佳乐（戊酸雌二醇片），由拜耳医药保健有限公司出品，1 mg/片（批号2016278A）。

小鼠血清分析试剂为上海沪鼎生物科技有限公司的Mouse E2 ELISA Kit（货号E-20380），Mouse FSH ELISA Kit（货号E-20418），Mouse LH ELISA Kit（货号E-20638）。

1.1.3 主要仪器 酶标仪（型号为Multiskan FC，美国Thermo Fisher Scientific公司），微孔板恒温振荡器（型号为MB100-4P，杭州汇尔仪器）。

1.2 方法

1.2.1 造模 选择性周期正常的健康雌性C57BL/6J小鼠42只随机分为2组，空白对照组7只，造模组35只。空白对照组予等容量生理盐水灌胃。造模组参照文献[8-9]造模方法，用雷公藤多苷片50 mg/（kg·d），连续灌胃14 d造模。模型建立开始，每天通过观察小鼠阴道脱落细胞涂片，了解小鼠动情周期变化，当出现动情周期延长，阴道角化上皮细胞减少，有核上皮细胞混杂，表示建立模型成功。

1.2.2 分组及干预 造模成功后，将模型小鼠分为模型组及治疗组。其中治疗组包括益真低、中、高剂量组和西药组。益真低剂量组：仙子益真胶囊0.75 g/（kg·d），益真中剂量组：仙子益真胶囊1.5 g/（kg·d）。益真高剂量组：仙子益真胶囊3 g/（kg·d），西药组：补佳乐0.15 mg/（kg·d），模型组及空白对照组等容量生理盐水灌胃。每天1次，连续21 d。

1.2.3 检测指标 末次给药结束后，各组小鼠禁食24 h，不禁水，取血3 mL，将所取血静置30 min，2 000 r/min，离心10 min，取血清，ELISA 法测定血清E2、FSH、LH的含量，具体操作严格按药盒说明进行。

1.2.4 统计学分析 数据采用SPSS 20.0统计分析软件处理，计量资料数据以“x±s”表示，所有资料进行正态性检验，符合正态分布者，多组计量资料采用单因素方差分析，方差齐者，对两个变量之间计量资料的比较行t检验，以P<0.01为差异具有统计学意义。

2 结果

与空白对照组比较，模型组E2含量下降，FSH、LH含量升高，差异有统计学意义（P<0.01），从激素水平提示造模成功。与模型组比较，益真低剂量组、益真中剂量组、益真高剂量组、西药组E2含量上升，FSH、LH含量下降，差异有统计学意义（P<0.01）。可见通过补肾填精中药治疗，改善了POF小鼠的性激素分泌水平。见表1。

3 讨论

POF目前尚无理想的治疗方法。对于无生育要求的患者，目前国内外的治疗均以激素替代疗法（hormone replacement therapy，HRT）治疗为主，维持其月经周期来潮及体内激素水平的稳定。但大量的研究证实长期应用HRT将增加乳腺癌、冠心病、卒中、阿尔茨海默病等的风险[10]。开拓新的治疗方法，是POF治疗中需面临的问题。

近年来，中医药治疗POF有了很大的进展。动物实验方面，张军武[11]研究发现归肾丸能够降低POF大鼠血清中LH水平及升高E2含量，增大卵巢体积，优化卵泡质量，促使排卵；高慧等[12]研究发现补肾调冲方能使POF大鼠的卵泡数明显增多，卵巢血供丰富，FSH及LH水平下降，E2水平上升。临床治疗方面，许多医家对POF进行分型论治，饶辉[13]将POF分为肝肾阴虚型、脾肾阳虚型、肝气郁结型3型；黄爱萍等[14]将POF分为肝郁肾虚型、肾阳虚弱型、血虚火旺型3型治疗，效果确切；另有医家将月经周期分为月经后期、经间期、经前期、月经期四期，根据每个时期不同的特點来进行序贯用药[15-17]；解娟等[18]采用滋肾育胎丸联合克龄蒙治疗POF，其临床各种症状，LH、FSH、E2含量，子宫内膜的改善程度均优于单用克龄蒙。另外还有针灸治疗，也取得一定的效果[19-20]。由此可见中医药治疗POF有着一定的优势，己经展现出广阔的前景。

中医学认为， 肾为先天之本，藏精而主生殖，是人体生长发育、生殖的根本，故肾气盛，则天癸按期而至，任通冲盛，月事如期而至，阴阳和而有子；肾气盛，则肾精充足，化血有源，而血为女子月事来潮的根本，乃孕育之基础。李丽芸教授认为，肾虚是POF的主因，是卵子难以发育成熟、排出障碍的根本原因。肾阴不足，则难以聚而为精，卵子缺乏形成的物质基础不能充分发育成熟；肾阳不足，则卵子缺乏排出的动力；肾精不足，肾阴阳俱虚，则卵巢功能不能正常发挥，这些都会导致无排卵，黄体功能不健，甚至卵巢早衰。因此，在治疗上，调经当以补肾气、益精血、培元固本、调养冲任为大法。现代药理研究表明，熟地黄通过提高血中抗氧化相关酶的活性，有很好的抗氧化作用[21]；女贞子、旱莲草有抗衰老的作用[22-23]；菟丝子可升高去势雌性大鼠胸主动脉平滑肌细胞雌激素受体数量[24]；淫羊藿对小鼠卵泡颗粒细胞分泌雌二醇有直接刺激作用[25]。仙子益真胶囊选用熟地黄、女贞子、旱莲草养血滋阴、填精益髓为君药，川断补肾暖腰膝为臣药，佐以菟丝子、淫羊藿温肾壮阳、补阳益阴，使其“阳得阴助而生化无穷，阴得阳升而泉源不竭”，以提升卵巢功能。

FSH和LH为促性腺激素，由腺垂体促性腺细胞分泌，是卵泡发育的必要激素，并能调节体内E2的分泌。POF患者卵泡数目减少，由卵泡产生的E2也随之降低，低水平的E2能够通过下丘脑-垂体-卵巢轴的反馈作用，促进垂体FSH分泌，从而导致FSH水平升高。反之，卵泡活动的恢复则表现为血液循环中FSH下降，E2升高[26]。本研究结果表明补肾填精中药仙子益真胶囊治疗POF的作用机制可能是通过调节下丘脑-垂体-卵巢轴功能，从而干预应激所致的雌性小鼠生殖内分泌功能下降，提升卵巢功能。其作用途径还有待于进一步探讨。

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