清霾饮防治PM2.5致大鼠肺损伤的研究

赵群菊　田珺　郭时印　蒋俊和

〔摘要〕 目的 研究清霾飲对大气细颗粒物PM2.5所致大鼠肺损伤的防治作用。方法 将健康成年SD大鼠50只随机分为空白组、PM2.5染毒组、清霾饮低剂量干预组、清霾饮中剂量干预组、清霾饮高剂量干预组。采集空气中细颗粒物制成染毒造模所需浓度为37.5 mg/mL的颗粒物混悬液处理大鼠建立肺损伤模型，并给予不同剂量清霾饮进行干预。最后一次染毒48 h后，收集腹主动脉血及右侧肺组织支气管肺泡灌洗液，测定血清中酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）活性和支气管肺泡灌洗液（BALF）中ACP、LDH活性，并观察左侧肺组织病理学改变。结果 与空白组相比，PM2.5染毒组BALF及血清中ACP、LDH的活性均明显升高；血清中GSH-Px活性降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。与PM2.5染毒组相比，清霾饮低剂量干预组各测定指标差异均无统计学意义（P>0.05）；而清霾饮中、高剂量干预组大鼠BALF及血清中ACP、LDH活性明显降低；血清中GSH-Px活性升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 清霾饮能拮抗PM2.5对肺组织所产生的炎性及氧化损伤，对肺组织有保护作用。

〔关键词〕 细颗粒物（PM2.5）；清霾饮；支气管肺泡灌洗液；肺损伤

〔中图分类号〕R285.5；R256.1 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.09.006

〔Abstract〕 Objective To investigate the significance of Qingmai Decoction in the prevention and treatment of fine particulate matter （PM2.5）-induced pulmonary impairment in rats. Methods Fifty healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank group， PM2.5 exposure group， low-dose Qingmai Decoction group， medium-dose Qingmai Decoction group， and high-dose Qingmai Decoction group. Fine particles in the air were collected and made into a liquid suspension with a concentration of 37.5 mg/ml， which was used to treat rats to establish a model of pulmonary impairment. Rats were given different doses of Qingmai Decoction for intervention. At 48 hours after the last exposure， abdominal aortic blood and bronchoalveolar lavage fluid （BALF） of the right lung were collected to determine the activity of acid phosphatase （ACP） and lactic dehydrogenase （LDH） in serum and BALF as well as the activity of glutathione peroxidase （GSH-Px） in serum. Pathological section of the right lung lobe was evaluated. Results Compared with the blank group， the PM2.5 exposure group had significantly higher activity of ACP and LDH in BALF and serum and significantly lower activity of GSH-Px in serum （P<0.01）. There were no significant differences in any indices between the PM2.5 exposure group and low-dose Qingmai Decoction group （P>0.05）. Compared with the PM2.5 exposure group， the medium- and high-dose Qingmai Decoction groups had significantly lower activity of ACP and LDH in BALF and serum and significantly higher activity of GSH-Px in serum （P<0.05）. Conclusion Qingmai Decoction can protect the lung tissue by antagonizing the PM2.5-induced inflammatory and oxidative damages.

〔Keywords〕 fine particulate matter（PM2.5）； Qingmai Decoction； bronchoalveolar lavage fluid； pulmonary impairment

随着我国工业化和城市化进程的迅猛发展，紧随其后的持续雾霾天气引起了人们的广泛关注，雾霾不仅影响着气候、环境、经济及社会的发展，更严重地威胁到人类的健康。雾霾对人体最大的危害是呼吸系统的损伤[1]。雾霾主要的致病因子是大气中的细颗粒物（多为PM2.5），其进入肺组织后，引起机体炎性介质的过度释放与聚集导致局部发生氧化应激和炎症反应，损伤呼吸道黏膜上皮细胞，引起气道炎症，而部分细颗粒物可沉积在肺泡或肺间质内，影响巨噬细胞功能，引起肺部炎性损伤[2-4]。清霾饮方源于汉代张仲景的“桔梗汤”，《伤寒论》311条载：“少阴病，二三日，咽痛者，可与甘草汤。不瘥者，与桔梗汤”，后世名甘桔汤，全方具有宣肺止咳，利咽解毒，祛痰排脓之功，是治疗咽喉痛的基本方。前期研究发现桔梗[5]、甘草[6]具有抗炎作用，清霾饮在此基础上加用了具有清热解毒作用的野菊花[7]、山银花[8]及具有抗氧化作用的荷叶[9]、鱼腥草[10]、红景天[11]，以上诸药配伍有助于防治肺部炎性损伤。本研究采用细颗粒物PM2.5染毒处理大鼠建立肺损伤模型，给予不同剂量清霾饮进行干预，探讨清霾饮对大气PM2.5致肺损伤大鼠的干预作用及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

崂应2020型空气采样器、玻璃纤维滤膜（青岛崂山应用技术研究所）；MK3酶标仪（Thermo公司）；H1850型台式高速离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）。酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）试剂盒（批号：20170310），乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，

LDH）试剂盒（批号：20170310），谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）试剂盒（批号：20170310），酶标板，均购于南京建成生物工程研究所。

1.2 PM2.5采集与混悬液制备

于2016年11-12月对湖南农业大学前草坪及长沙县规范化养殖场几个污染程度不同的采样点，用崂应2020型空气采样器（电子流量计）采集大气PM2.5细颗粒物于玻璃纤维滤膜上，24 h不间断采样，连续采样1个月。将吸附有PM2.5的滤膜剪短对折浸入超纯水中，低温超声震荡30 min，共3次，洗脱PM2.5。用6层纱布过滤洗脱的PM2.5，滤液用4 ℃、1 000 r/min、15 min离心3次，弃上清液，称量后-20 ℃保存，用0.9%生理盐水配制成浓度为37.5 mg/mL的颗粒物混悬液，4 ℃冰箱备用[12]。使用前超声震荡15 min，混匀混悬液并灭菌。

1.3 药品的准备

清霾饮组方：桔梗6 g，野菊花6 g，山银花6 g，红景天9 g，鱼腥草10 g，荷叶10 g，甘草3 g。以上饮片均购自老百姓大药房连锁股份有限公司，经鉴定符合药典规定。按中药常规煎法进行煎煮，将以上饮片以500 mL水浸泡30 min，加热至沸腾后，保持微沸30 min，过滤；残渣加300 mL水，进行二次煎煮，保持微沸30 min，过滤，合并两次的过滤药液，将药液浓缩至生药量0.062 5 g/mL。

1.4 实验动物分组与给药方法

健康成年的SPF级SD大鼠50只，雌雄各半，体质量180～220 g，由湖南中医药大学实验动物中心提供，许可证：SCXK（湘）2013-0005，SPF级实验室分笼饲养，饲养温度18～22 ℃，相对湿度45%～55%，12 h昼夜交替，适应性喂养1周。将大鼠随机分为5组，每组10只，分别为空白组、PM2.5染毒组、清霾饮低剂量干预组、清霾饮中剂量干预组、清霾饮高剂量干预组。染毒造模：空白组大鼠用气管滴注0.9%氯化钠溶液（8.0 mg/kg）；染毒组及清霾饮低、中、高剂量干预组大鼠气管滴注细颗粒物（8.0 mg/kg），均每周1次，共 4 次[11-12]。给药干预：空白组、PM2.5染毒组用蒸馏水1.5 mg/kg灌胃；清霾饮低、中、高剂量干预组初次染毒后24 h即分别给予清霾饮按不同剂量（125、250、500 mg/kg）进行灌胃，均1次/d，给药30 d。

1.5 標本采集与检测

最后一次染毒48 h后，对大鼠予以10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉，待麻醉成功后，腹主动脉取血5 mL，3 000 r/min离心15 min取血清，-20 ℃冰箱保存，用于酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）活性的测定。结扎左侧肺支气管，该侧用于肺组织病理检查取样，取每只大鼠左侧的肺脏中叶组织，切取0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小组织3块，置于10%甲醛固定液中固定，石蜡包埋，5 μm连续切片，切片行HE常规染色后由两位不了解实验分组情况的观察者在光镜下观察肺组织病理学改变并按如下标准对肺损伤进行评分[12]：每张切片于200倍视野下计数10个随机区域，根据水肿、炎细胞浸润及出血情况设置分值，0分=正常，1分=轻度损伤（小于25%的肺组织出现损伤），2分=中度损伤（25%～50%的肺组织出现损伤），3分=重度损伤（50%～75%的肺组织出现损伤），4分=超重度损伤（大于75%的肺组织出现损伤），取三种不同类型损伤的平均分作为该区域的肺损伤分值。未结扎的右侧肺用37 ℃预温PBS 3.5mL灌洗肺部，反复3～4次，收集支气管肺泡灌洗液（BALF）约5 mL，3 000 r/min离心20 min，留取上清液，分装后-20 ℃冰箱保存，用于ACP、LDH活性的测定。

1.6 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量资料以“x±s”表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者采用SNK-q检验，方差不齐者用DunnettT3检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠BALF中ACP、LDH检测结果

与空白组相比，PM2.5染毒组大鼠BALF中ACP、LDH的活性明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）；与PM2.5染毒组相比，清霾饮中、高剂量干预组大鼠BALF中ACP、LDH活性明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05），但低剂量干预组与染毒组相比差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠血清中ACP、LDH、GSH-Px检测结果

与空白组相比，PM2.5染毒组大鼠血清中ACP、LDH的活性明显升高、GSH-Px活性降低，差异具有统计学意义（P<0.01）；与PM2.5染毒组相比，清霾饮中、高剂量干预组大鼠血清中ACP、LDH活性明显降低、GSH-Px活性升高，差异具有统计学意义（P<0.05），但清霾饮低剂量干预组与染毒组相比差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠肺组织病理学观察结果

由图1可知，空白组（图1A）大鼠的肺泡分布均匀，结构完整，肺泡腔和肺间质内可见少量的炎症细胞浸润。PM2.5染毒组（图1B）大鼠肺泡间隔增宽，肺泡腔增大，部分肺泡断裂、融合，肺泡腔和肺间质可见有大量的炎症细胞浸润及少量PM2.5黑色颗粒的聚集。清霾饮低剂量干预组（图1C）大鼠肺泡腔增大、融合，肺泡腔和间质可见明显的炎症细胞浸润，未见颗粒物沉积。清霾饮中剂量干预组（图1D）大鼠肺泡腔结构较完整，肺泡腔炎症细胞浸润明显减轻，肺间质炎症细胞浸润有所改善，未见颗粒物沉积。清霾饮高剂量干预组（图1E）大鼠大部分肺泡结构完整，部分区域的肺间质有少量的炎症细胞浸润，镜下未见黑色颗粒物。肺组织病理学评分：与空白组相比，PM2.5染毒组肺组织病理学评分升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；与PM2.5染毒组相比，清霾饮中、高剂量干预组肺组织病理学评分下降，差异具有统计学意义（P<0.05），清霾饮低剂量干预组与染毒组相比差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3 讨论

雾霾对人类健康的危害巨大，尤其是PM2.5被公认为危害最大。PM2.5是一种肺部可吸入的毒性因子，大量研究显示人体暴露于PM2.5中将会对机体健康产生严重的损害，能引起各种呼吸道疾病，如哮喘、肺功能下降、肺癌等，甚至导致心血管疾病及免疫系统崩溃等[13-14]。我国一项关于PM2.5污染与居民每日病死率关系的Meta分析证实[15]，PM2.5浓度每升高10 ？滋g/m3，我国、北美和欧洲地区居民每日死亡率分别上升0.31%、1.26%和1.65%；呼吸系统疾病每日死亡率上升1.00%、1.78%、1.32%。也就是说，大气中PM2.5浓度升高大大增加了居民的发病率和死亡率。因此，明确PM2.5致肺损伤的机制，探索拮抗肺损伤物质的研究迫在眉睫。目前，已有许多研究对PM2.5致肺损伤的机制进行了探索，多认为炎性损伤及氧化应激损伤是其中心机制[16-18]。本研究结果显示，PM2.5气管滴注能引起大鼠血清及BALF中ACP活性的增加；血清中GSH-Px活性降低。ACP是确定炎症反应的重要指标；GSH-Px是一种重要的自由基清除剂，可保护机体细胞免受氧化损伤，研究结果说明PM2.5滴注能引起大鼠肺部炎性及氧化性损伤，与杨露等[16]的研究结果一致。在以往的研究中，LDH被作为反映颗粒物细胞毒性的敏感指标，当细胞膜受到损伤后其通透性增强，LDH大量逸出胞外，可提示肺通透性损伤。本研究中，滴注PM2.5后大鼠BALF及血清中LDH活性均较空白组明显升高，提示大鼠肺通透性受到损伤。经清霾饮干预后，结果显示，清霾饮中、高剂量组大鼠BALF及血清中ACP活性随干预剂量的增加而降低，提示清霾饮对PM2.5引起的肺部炎症有一定减轻作用；而清霾饮中、高剂量组大鼠BALF及血清中LDH活性降低，说明PM2.5对细胞的毒性作用得到了抑制，细胞膜受损情况有所改善；血清中GSH-Px活性升高，说明清霾饮对PM2.5所致肺损伤有一定的减轻作用。而清霾饮低剂量组大鼠血清中ACP、LDH、GSH-Px活性及BALF中ACP、LDH活性与PM2.5染毒组无异，说明低浓度的清霾饮药效达不到防治PM2.5所致肺损伤的作用。肺病理学检查结果同样显示清霾饮中、高剂量对PM2.5气管滴注染毒引起的肺泡間隔增厚、炎细胞浸润及细胞水肿等病理改变有减轻作用。上述结果表明清霾饮干预对PM2.5引起的肺损伤有一定减轻作用。

随着人们健康意识的提高及对PM2.5致机体损伤机制研究的深入，学者们开始试图寻找合理有效的抗PM2.5损伤的物质。清霾饮的组方为桔梗、甘草、野菊花、山银花、红景天、鱼腥草、荷叶、甘草。本方源于汉代张仲景的“桔梗汤”，桔梗汤的原方只含桔梗、甘草两味，临床上治疗咽喉痛诸方大多由此加味而成。桔梗味苦、辛、平，归肺经，具有宣肺利咽、祛痰排脓的作用；甘草味甘、平，归心、肺、脾、胃经，能补脾益气、祛痰止咳、清热解毒、缓急止痛、调和诸药。二者配伍使用，增强了宣肺止咳、利咽解毒、祛痰排脓之功。现代药理研究发现桔梗汤宣肺止咳、利咽解毒、祛痰排脓的功效与抗炎、祛痰等作用有关，其主要活性成分为桔梗皂苷和甘草皂苷[19]。鱼腥草味辛、微寒，归肺经，具有清热解毒、消痈排脓的之功，为臣。有研究发现鲜鱼腥草挥发油可抑制脂多糖（LPS）诱导的慢性肺损伤大鼠模型肺组织中白介素-8（IL-8）、丙二醛（MDA）的产生， 从而发挥其抗炎、抗氧化作用[20]。红景天味甘、苦、平，归肺，心经，具有益气平喘、活血通脉的作用为佐。龚晓武等[21]对红景天黄酮抗氧化能力的研究发现当红景天黄酮浓度为0.2 mg/mL时， 对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的清除作用均高于50%， 且随浓度的增高其清除自由基作用增强，这表明红景天黄酮具有良好的抗氧化活性作用。野菊花和山银花同属于清热类中药，性寒、味苦，均具有清热解毒的功效，其黄酮类成分是目前国内外公认的抗氧化活性成分之一， 具有广谱抗菌、抗病毒、抗炎、解热等抗氧化保护作用[22-23]。荷叶性平， 味苦， 归肝、脾、胃经， 具有清暑化湿、凉血止血等功效为本方的佐助药。有实验研究发现荷叶黄酮具有显著的自由基清除活性，是重要的抗氧化活性物质[9]。

综上所述，清霾饮能减轻PM2.5所致大鼠肺损伤，其保护机制可能与减轻肺部炎症反应及氧化应激反应有关，这为防治大气PM2.5致肺损伤提供了新的思路与方法。

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（本文编辑 李 杰）