漆酶协同活性炭处理脱除桉木预水解液中木素的研究

董吉冉 陈嘉川 吉兴香

摘 要：为了脱除桉木预水解液中的小分子木素，采用漆酶协同活性炭处理方法，对经过Ca（OH）2和活性炭分别处理过的二级桉木预水解液进行脱木素处理，探讨漆酶处理过程中pH值、处理温度、漆酶用量和处理时间对木素脱除效率的影响。采用单因素实验结合响应面法对上述主要因素进行了模型分析与验证，建立了小分子木素脱除的数学模型。结果表明，经过漆酶处理后的二级处理液，其木素脱除率比未用漆酶处理的提高了12.8个百分点。二级处理液中木素脱除率的4个因素影响大小的顺序为：pH值>漆酶用量>处理温度>处理时间。漆酶协同活性炭处理的较优工艺条件为：pH值为5.23、处理温度45.3℃、漆酶用量5.68 U/g（相对于处理液质量）、处理时间190 min，此条件下二级处理液中木素脱除率的预测值为65.1%，实际测定平均值为65.1%，木素脱除率为桉木预水解液所含木素的90.5%。

关键词：桉木；预水解液；漆酶；活性炭；小分子木素

中图分类号：TS71；TS245.8

文献标识码：A

DOI：10.11980/j.issn.0254-508X.2018.09.002

Abstract：In this work， laccase combined with activated carbon were used to remove small molecular lignin from secondary Eucalyptus pre-hydrolysis liquid which was treated with Ca（OH）2 and activated carbon successively. The effects of pH value， treatment temperature， laccase dosage and treatment time on lignin removal efficiency were analyzed. The main factors were analyzed and verified by single factor experiment and response surface method， and a mathematical model for the removal of small molecule lignin was established. The results showed that compared with secondary purified liquid without laccase treatment， the lignin removal rate increased by 12.8 percentage points after laccase treatment. And the 4 main factors affecting lignin removal rate from strong to weak were： pH treatment value of laccase >laccase dosage> treatment temperature>treatment time. Under the optimum treatment condition （pH=5.23， temperature 45.3℃， laccase dosage 5.68 U/g purified liquid and treatment time 190 min）， the predicted maximum lignin removal rate in the liquid solution was 65.1%， and the actual measured value 65.1%. The lignin removal rate was 90.5% based on the Eucalyptus pre-hydrolysate.

Key words：Eucalyptus； pre-hydrolysis liquid； laccase； active carbon； small molecular lignin

近年來，溶解浆的市场需求量呈现逐年增高的趋势，在生产硫酸盐阔叶木溶解浆的过程中，一般先进行预水解溶出部分半纤维素，以降低后续工段木质纤维组分分离过程中的化学品消耗量，提高溶解浆的品质，同时也会产生大量预水解液，预水解液中水分含量较高（>90%），各种半纤维素含量也较高，但各种半纤维素的热值（13.6 MJ/kg）仅为木素（27 MJ/kg）的1/2。部分企业在生产中通常将预水解液与黑液一起燃烧产生热量，因而造成了半纤维素资源的浪费[1-3]。目前，生物质精炼受到人们越来越多的重视，如何高效环保地利用预水解液中的溶解有机物，成为当今科研工作者的研究热点。阔叶木预水解液中包含大量的半纤维素、糠醛、乙酸等溶解有机物，可用来生产多种高附加值产品，如木糖醇、燃料乙醇、生物柴油、乙酸、糠醛、树脂等[4-6]；特别是预水解液中的大量低聚木糖可用来生产多种保健功能性低聚糖产品，在食品医药行业受到广泛关注[7]。当前从水解液中提取低聚木糖的方法较多，如膜处理、乙醇沉淀、有机溶剂萃取等。Wang Q等人[8]以水热预处理液为原料，通过纳滤和漆酶处理得到浓缩的半纤维素糖液；Blanc C L等人[9]对预水解液进行纯化，从半纤维素糖液中提取戊糖； Yang G等人[10-11]以预水解液为原料，利用三辛胺/正辛醇系统将乙酸萃取出来，之后又利用氢氧化钠进行反萃取进而生产乙酸；Ahsan L等人[12]和Baktash M M等人[13]以工业预水解液为原料，生产糠醛。由此可见，要想利用预水解液中溶解的有机物生产高附加值产品，首先要将水解液进行纯化。而预水解液中的有机物成分复杂，主要是低聚木糖、木糖和木素，其中，木素的存在不利于木糖的提取与高值化利用，易导致木糖产品纯度和质量降低。因此，如何有效地去除预水解液中的木素是生产木糖基高附加值产品的重要基础。

近年来，去除预水解液中木素的方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法主要指活性炭处理，利用其丰富的微孔以及巨大的比表面积来吸附木素，该方法成本低、污染小，但对于预水解液中尺寸较小或较大的木素，活性炭吸附能力较弱。Shen J等人[14]利用活性炭结合离子交换树脂和膜过滤来脱除预水解液中的木素，木素的脱除率达到90%，但处理成本相对较高。Chandel A K等人[15]用活性炭处理预水解液，可脱除38.7%的呋喃，57%的酚类物质。化学法主要包括聚电解质法和酸析沉淀法。聚电解质法是通过加阳离子聚电解质发生电荷中和反应，形成絮聚体，然后离心过滤以脱除预水解液中的木素。酸析沉淀法则主要用于碱处理预水解液的纯化。Duarte G V等人[16]采用阳离子絮凝剂聚二烯丙基二甲基氯化铵可脱除36%的木素。Liu Z H等人[17]在室温下向预水解液中加入质量分数20%的硫酸，调节预水解液pH值为2，此时木素去除率为50%，但糖类损失16%。可见，化学法脱除木素效果不理想，而且会对环境产生污染。生物法主要是利用漆酶氧化苯酚末端基形成較稳定的自由基，自由基之间再耦合形成共价键，小分子木素缩合形成大分子[18-19]。该法操作简单、效果明显，是一种环境友好型的处理方法，近年来在纯化预水解液方面得到了较广泛的研究和应用。Kolb M等人[20]利用0.2～0.5 U/mL的漆酶处理水解液24 h，几乎所有的木素降解产物被脱除；Wang Q等人[21]通过漆酶处理预水解液，发现漆酶处理后，木素的相对分子质量提高了160%，之后通过絮聚除去，木素脱除率由11%提高到46%～61%。

本课题针对预水解液中小分子木素难脱除的问题，通过漆酶处理诱导其缩合[22]，调节小分子木素的尺寸，使其尺寸达到活性炭易于吸附的范围，并利用响应面法建立漆酶用量、pH值、处理温度、处理时间与木素脱除率之间的数学模型，以减少传统多因素正交实验的误差，缩短优化时间，提高结果的准确度。

1 实 验

1.1 实验原料及试剂

桉木预水解液由山东太阳纸业有限公司提供；漆酶购于诺维信公司（酶活5000 U/mL）；活性炭（磷酸活化、木质、过200目）购于广东海燕活性炭有限公司；Ca（OH）2和H2SO4均为分析纯，购于天津恒兴公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桉木预水解液二级处理液的制备

向桉木预水解液中加入1.5%（以预水解液质量计）的Ca（OH）2，处理10 min后离心，取上清液，称为一级处理液；向一级处理液中加入1.0%的活性炭，吸附5 min后离心过滤，取上层清液，称为二级处理液。各级处理液中木素含量及总木糖的含量如表1所示。其中，活性炭处理木素脱除率为53.5%，总木糖损失率为5.9%。

1.2.2 漆酶处理二级处理液

对照组：取180 g二级处理液平均分成6组置于锥形瓶中，未加入漆酶，将锥形瓶放入摇床中，在150 r/min下处理3 h。处理结束后，分别向各组中加入1.0%活性炭（AC-raw）（以二级处理液质量计以下同），置于磁力搅拌器上，250 r/min下搅拌5 min，然后在4500 r/min下离心3 min，取上清液，用于木素含量的测定。离心所得活性炭记为AC-1。

实验组：另取180 g二级处理液平均分成6组置于锥形瓶中，各组分别加入30 μL漆酶溶液，将锥形瓶放入摇床中，重复上述实验过程。离心所得活性炭记为AC-2。

1.2.3 漆酶协同活性炭处理后木素及总木糖含量的测定

取180 g上述经过漆酶处理过后的二级处理液，平均分为6组，置于锥形瓶中，向锥形瓶中分别加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的活性炭，置于磁力搅拌器上，在250 r/min下搅拌5 min，然后在4500 r/min下离心3 min，取上清液，用于木素及总木糖含量的测定。

木素含量的测定：木素含量的测定按照GB/T 2677.8—1994进行。将上清液稀释适宜倍数，采用紫外分光光度计检测上清液样品在205 nm处的吸光值，木素含量计算如公式（1）所示。

B=A·D/110（1）

式中，B为上清液中的木素含量，g/L；A为稀释后的上清液样品在205 nm处吸光值；D为上清液样品的稀释倍数；110为吸光系数，L/（g·cm-1）。

总木糖含量测定：取5 mL上清液放入耐压瓶中，加入174 μL、质量分数为72%的H2SO4，将耐压瓶密封后放入油浴中，121℃下反应60 min进行酸水解[23]。将经酸水解之后的上清液，再稀释4000倍，采用ICS-5000型离子色谱测定仪测定木糖含量，即为上清液中总木糖含量。

1.3 检测

1.3.1 FT-IR表征

取1 mg吸附二级处理液前后的活性炭样品，与100 mg干燥的KBr经玛瑙研钵研磨后压片，置于Vertex70傅里叶变换红外光谱分析仪（FT-IR）（德国布鲁克Vertex70）中测试，扫描范围为250～4250 cm-1，扫描次数为16次。

1.3.2 比表面积测试

取0.1 g 吸附二级处理液前后的活性炭样品置于样品管中，在比表面积测定仪（北京金埃谱v-sorb2008p）中进行测试，测试方法为等温（77 K）N2吸附法。

1.3.3 TEM分析

将吸附二级处理液前后的活性炭，分别用水稀释一定浓度后，超声处理10 min，使其均匀分散，后滴加少量含活性炭的悬浊液于铜网上，60℃下烘干。然后置于JEM-2100高分辨透射电子显微镜（TEM）（日本电子公司JEM-2100）下观察，所用电压为200 kV。

2 结果与讨论

2.1 活性炭用量对漆酶处理后二级处理液中木素脱除率及总木糖损失率的影响

活性炭用量对漆酶处理后二级处理液中木素脱除率及总木糖损失率的影响见图1。

由图1中可以看出，随着活性炭用量的不断增加，木素脱除率呈现先快速增加后缓慢增加的趋势，总木糖损失率呈现先缓慢增加后快速增加的趋势。这主要是因为活性炭吸附具有选择性，即活性炭会优先选择吸附木素。在活性炭用量小于1%时，由于漆酶处理后二级处理液中小分子木素被漆酶缩合为较大相对分子质量的木素，使得木素易于被活性炭吸附[24]，但同时由于木素占据了活性炭较多活性位点，使得活性炭对糖的吸附作用不明显，总木糖损失率较低；随着活性炭用量的不断增加，在活性炭用量为1.2%时，由于漆酶处理后二级处理液中木素含量有限，但活性炭中吸附位点较多，除了吸附木素分子之外，对糖的吸附也明显增加，总木糖损失率高达7.0%。另外，由于活性炭对木素的吸附能力高于木糖[24]，由表1可知，在活性炭处理二级处理液过程中，活性炭吸附了53.5%的木素，而对木糖的吸附仅为5.9%。这表明在漆酶协同活性炭处理二级处理液的过程中，会优先吸附木素，但随着木素濃度的不断降低，活性炭剩余的活性位点开始吸附木糖。当活性炭用量为1.0%时，此时的木素脱除率较高为64.5%，总木糖损失率较低为3.3%。因此，后续实验均采用1.0%的活性炭用量。

2.2 漆酶处理对二级处理液中木素脱除效果的影响

以未经漆酶处理的二级处理液作为对照组，经过漆酶处理的二级处理液作为实验组，漆酶处理对二级处理液中木素的脱除效果的影响见表2。

由表2可以看出，在相同处理条件下，与对照组相比，实验组的木素脱除率提高了12.8个百分点。漆酶处理后二级处理液中的木素浓度为0.94 g/L，相对于桉木预水解液中的木素（9.72 g/L），木素脱除率为90.3%。由此说明，经过漆酶处理后，二级处理液中的小分子木素更容易脱除。

2.3 单因素优化漆酶处理工艺条件

漆酶处理过程中酶用量、pH值、处理温度、处理时间对二级处理液中木素脱除率的影响见图2。

由图2（a）中可以看出，随着漆酶用量的不断增加，木素脱除率呈现先增加后平缓下降的趋势，这可能与漆酶自身性质有关[25]，漆酶对木素既有缩合作用也有解聚作用[26]，在漆酶用量较少时，基于二级处理液中的木素含量较低，且相对分子质量较小，漆酶对木素主要体现为缩合作用，使木素尺寸与活性炭的孔径更为相近，木素更易于被活性炭吸附，因而木素脱除率增加。当漆酶用量增加到5 U/g时，漆酶的缩合作用与解聚作用相当，反应达到平衡，此时木素脱除率最大，为64.5%；随着漆酶用量的继续增加，漆酶解聚作用占据优势，缩合的木素小分子被漆酶解聚，使得木素脱除率降低[18]。因此，当漆酶用量为5 U/g时，对二级处理液中木素的脱除效果较好。由图2（b）看出，随着pH值的不断增加，木素脱除率呈现先明显增加后逐渐下降的趋势。在pH值为5时，木素脱除率达最高值，为64.5%，这说明漆酶在pH值为5时具有较高的催化活性，对木素的降解效果较好。当pH值为6～8时，木素脱除率有所下降，但并不明显，这说明漆酶在弱碱环境下，仍具有良好的催化活性。由图2（c）可以看出，随着处理温度的不断增加，木素脱除率呈现先增加后降低的趋势，当处理温度为45℃时，木素脱除率最高。这说明该漆酶在45℃时具有较高的催化活性，对木素的脱除效果较好。由图2（d）可以看出，随着处理时间不断延长，木素脱除率先增加后趋于稳定，在处理时间为3 h时，木素脱除率最高。

2.4 响应面分析法优化漆酶处理工艺条件

2.4.1 响应面实验设计方案与响应值结果

在单因素实验基础上，利用Design-Expert 8.0.6软件设计了漆酶处理二级处理液中木素的实验，并对实验数据进行了回归验证和响应面分析法。在此验证过程中，各因素和水平见表3，响应面实验设计方案与响应值结果见表4。

2.4.2 模型建立与方差分析

模型方差分析和回归系数显著性验证结果如表5所示，再利用Design-Expert 8.0.6软件对表5数据进行回归拟合，得到了响应值木素脱除率R对影响木素脱除率的的主要因素的二元多项式回归模型如公式（2）所示。

R=64.46+2.05A+2.49B+1.31C+1.69D+1.07AB-0.62AC-0.44AD-0.78BC-0.34BD-4.3CD-4.9A2-5.84B2-6.08C2-4.4D2（2）

由表5可以得出， 当P值<0.0001，失拟项不存在，表明该回归模型达到极为显著的水平。同时，该方程的回归系数R2=0.9411，说明该模型拟合度较高，可以用来分析及预测二级处理液中木素的脱除情况。另外，根据F值的大小表明4个因素对二级处理液中木素脱除率影响的大小顺序为： pH值>漆酶用量>处理温度>处理时间。

2.4.3 各因素交互作用结果

pH值、漆酶用量、处理温度和处理时间各因素之间交互作用对木素的脱除率结果如图3所示。

由图3（a）可知，在pH值小于5时，木素脱除率随漆酶用量的增加呈现先缓慢上升后逐渐下降的趋势。在pH值为5～6时，木素脱除率随漆酶用量的增加迅速上升至最高点，然后又快速下降。这主要是因为漆酶对溶液的pH值较为敏感， pH值的改变会影响酶活性基团的解离程度，同时还会影响底物和辅酶的解离和结合，因此在特定的pH值范围内，漆酶、底物和辅酶的离解状态较适宜，使得漆酶反应活性最高。

由图3（b）和图3（d）表明，当处理温度在35～55℃时，木素脱除率随pH值的增大或漆酶用量的增加，呈现先缓慢增加后逐渐减小的趋势。从酶促反应动力学角度分析可知，提高温度可以使酶催化反应速度加快。但是，若温度过高会导致酶蛋白因变性而失活，会降低酶催化反应速度。由图3（c）和图3（e）可知，在pH值或漆酶用量一定时，木素脱除率随时间的延长，先缓慢增加后缓慢下降。由图3（f）可知，木素脱除率随处理时间的延长先缓慢增大后逐渐减小；当处理温度较高时，木素脱除率随着处理时间的增大迅速增大后又快速减小。综上可知，当pH值为5、漆酶用量为5 U/g、处理温度45℃、处理时间3 h时，二级处理液的木素脱除率较高，为64.5%。

2.4.4 模型验证

基于Design-Expert软件的优化功能分析得出脱除二级处理液中木素的较优条件为：pH值为5.23、漆酶用量5.68 U/g、处理温度45.3℃、处理时间190 min，为了验证木素脱除模型的可靠性，在此条件下进行了4组模型验证实验，结果见表6。

由表6可以看出，4组模型验证实验所得木素脱除率的实际测定平均值为65.1%，与预测值的相对误差均在1.5%以下，这说明通过响应面法优化得到的脱除木素的工艺条件可信度较高。另外，结合表4可知，经过漆酶协同活性炭处理后，所得处理液中的木素相对于桉木预水解液的木素脱除率为90.5%。

2.5 FT-IR分析

活性炭吸附二级处理液前后的红外光谱图，如图4所示。

由图4可以看出，与未吸附二级处理液的活性炭（AC-raw）相比，吸附二级处理液之后的活性炭（AC-1、AC-2），在1425 cm-1处均出现吸收峰，该处为芳香核振动吸收峰；在1145 cm-1处出现不太明显的吸收峰，该处由愈创木基振动引起；在1030 cm-1处有较强的吸收峰，该处由愈创木基的C—H弯曲、伯醇C—O弯曲振动引起，这说明活性炭在处理二级处理液过程中吸附了部分木素，且AC-2在1030 cm-1处的吸收峰大于AC-1，这表明经过漆酶处理后，二级处理液中有更多的木素被活性炭吸附。

2.6 比表面积分析

活性炭吸附二级处理液前后的比表面积测定结果见表7。

由表7可以看出，与AC-raw相比，吸附二级处理液后的AC-1和AC-2的比表面积与孔体积均有大幅度减少，微孔面积与微孔体积均为0，说明活性炭吸附了大量的木素，且微孔对于木素的吸附能力更强。与AC-1相比，AC-2中孔比表面积与孔体积均有明显减小，这说明经过漆酶处理后的二级处理液中木素相对分子质量增大，达到了活性炭中微孔易于吸附的范围，由此说明漆酶可以缩合水解液中的小分子木素，使其更易于被脱除。

2.7 TEM分析

图5为活性炭处理二级处理液前后的透射電镜（TEM）图。

由图5可以看出，与未经过吸附处理的活性炭（图5（a））相比，经过吸附处理二级处理液后的活性炭（图5（b）和图5（c）），光透过性相对较差，晶格结构不太明显，这说明吸附处理二级处理液后的活性炭孔内吸附了大量的木素。另外，与AC-1相比，AC-2的光透过性下降更明显，这说明经过漆酶处理后，二级处理液中的木素更易于被活性炭吸附。因此，漆酶的加入有利于二级处理液中小分子木素的脱除。

3 结 论

采用单因素实验结合响应面法对影响漆酶协同活性炭处理脱除桉木预水解液中木素的各影响因素进行了优化研究。

3.1 与未用漆酶处理的二级处理液相比，经过漆酶处理后的二级处理液，其木素脱除率提高了12.8个百分点。

3.2 通过单因素实验结合响应面法对桉木预水解液的二级处理液中木素脱除率进行了模型分析与验证，得出二级处理液中木素脱除率4个因素的影响大小顺序为：pH值>漆酶用量>处理温度>处理时间。

3.3 漆酶协同活性炭脱除二级处理液中木素的较优工艺条件为：pH值为5.23、处理温度45.3℃、漆酶用量5.68 U/g处理液、处理时间190 min，在此条件下，二级处理液中木素脱除率的最大预测值为65.1%，实际测定平均值为65.1%，相对于桉木预水解液的木素脱除率达到90.5%。

参 考 文 献

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（责任编辑：吴博士）