人纤维蛋白原抗体的检测

闫晨 王强 堵疾 王文姬

【摘要】目的：根据人纤维蛋白原临床实验要求，对使用了一定量的人纤维蛋白原制品的病人血清中人纤维蛋白原有无抗体进行测定。方法：参照中国合格评定国家认可委员会CNAS-CL39等有关文件内容要求，结合本实验室的实际情况，制定了此方案。使用了上海双赢生物科技有限公司生产的人纤维蛋白原抗体酶联免疫分析定性试剂盒，对精密度、诊断敏感性、特异性、同一项目不同仪器的比对、CUTOFF值等各项参数在本实验室探究性地进行研究。结论：1.精密度的试验：3个样品连续检测10次后的CV分别为9.30%、14.1%、13.6%判断标准：CV小于15%，2.特异性实验：20份正常血清检测结果计算符合率为100%。3.诊断敏感性的验证：取10份已知真阳性的样本用常规检测方法检测，计算检测阳性的样本占样本总数的比例为100%。4.同一项目不同仪器的比对，MK3酶标仪CV%：3.28%-9.84%。TECAN.SPECTRA酶标仪CV%：2.82%-7.04%。5.CUTOFF值连续统计一段时间的检测结果，处于临界范围的结果比为0（小于50%判为合格）。

【关键词】人纤维蛋白原；抗体；临床实验；检测

1 实验原理

本试剂盒用双抗原夹心法测定标本中人纤维蛋白原抗体（FIB Ab）表达。用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，可与样品中纤维蛋白原抗体（FIB Ab）相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HIZP标记的抗原结合，形成抗原一抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HIZP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人纤维蛋白原抗体（FIB Ab）的存在与否。

2 项目测定

精密度（Precision），诊断敏感性（sensitivity of diagnosis）、特异性（specificity）、同一项目不同仪器的比对、CUTOFF值。

3 实验内容 （1）材料：人纤维蛋白原抗体（FIBAb）酶联免疫分析试剂盒（定性）；20份正常血清样本；112份临床使用了一定量的人纤维蛋白原制品的病人血清样本；10份己知真阳性的样本。使用仪器：用MK3酶标仪（已校验），TECAN.SPECTRA酶标仪（已校验）。 （2）试验步骤：见人纤维蛋白原抗体（FIB Ab）酶联免疫分析试剂盒（定性）说明书。 （3）精密度的试验：同一份样本在同一批次内平行重复检测10次.然后计算CV。

（4）特异性实验：20份正常血清检测结果，计算符合率。

（5）诊断敏感性的验证：取10份己知真阳性的样本，计算符合率。

（6）同一项目不同仪器的比对。

（7）CUTOFF值：连续统计一段时间的检测结果。

4 实验步骤

人纤维蛋白原抗体（FIB AB）酶联免疫分析试剂盒使用说明书，本试剂盒仅供研究使用。 （1）编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） （2）加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀， （3）温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

（4）配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

（5）洗涤：小L揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加滿洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍千。

（6）加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

（7）温育：操作同30

（8）洗涤：操作同50

（9）显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色巧分钟.

（10）终止：每孔加终止液501，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

（11）测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

5 实验结果

5.1 精密度的试验

同一份样本在同一批次内平行重复检测10次，然后计值，SD和CV.选取健康人血浆样本3份（从正常人血清中随机抽取），连续同一批次内平行重复检测10次，测得的结果如表2。

5.2 特异性实验：20份正常血清检测结果计算符合率

阴性对照平均值≤0.10。20份正常血清检测OD值均≤0.10。结果均阴性，阴性符合率100%。如表3。

5.3 诊断敏感性的试验

取10份己知真阳性的样本（样本来源困难时可以酌情减少）。用常规检测方法检测，计算检测阳性的样本占样本总数的比例。

从20批已检测的正常血清中任选10批，正常血清：阳性对照品=1：1的比例混匀，测得的结果见表3。10批阴性样品的OD均值为0.018，临界值为0.018+0.15=0.168.检测结果均大于临界值，故阳性的合格率为100%。

5.4 同一项目不同仪器的比对实验，用CV表示

表4与表5为相同样品同一时间不同型号酶标仪的检测结果。MK3酶标仪CV%：3.28%～9.84%。TECAN.SPECTRA酶标仪CV%：2.82%～7.04%。

5.5 CUTOFF值连续统计一段时间（共112个样品）的检测结果，处于临界范围的结果比例小于5%即可

对112个样品进行检测，平均每个样品检测三次所得CUTOFF均值为0.031。临界值为0.031+0.15=0.181.对照检测结果处于临界范围的结果比例为0。

6 实验结果评价与分析

计算和结果判定：

试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00；阴性对照平均值≤0.10。

临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15。

阴性判定：样品OD值<临界值（CUTOFF）者为纤维蛋白原抗体（FIB AB）阴性。

阳性判定：样品OD值≥临界值（CUTOFF）者为纤维蛋白原抗体（FIB AB）阳性。 （1）精密度的试验：3个样品连续检测10次后的CV分别为9.3%，14.1%，13.6%判断标准：CV小于15%， （2）特异性实验：20份正常血清检测结果计算符合率为100%。 （3）诊断敏感性的验证：取10份己知真阳性的样本用常规检测方法检测，计算检测阳性的样本占样本总数的比例为100%。

（4）同一项目不同仪器的比对，MK3酶标仪CV%：3.28%～9.84%o TECAN.SPECTRA酶标仪CV%：2.82%～7.04%。

（5）CUTOFF值验证连续统计一段时间的检测结果，处于临界范围的结果比为0，小于5%。

7 标本要求 （1）标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 （2）不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 （3）操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。

（4）试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

（5）浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

（6）封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

（7）底物请避光保存。

（8）试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为630nm

（9）所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M的硫酸，使用时必须注意安全。