口腔鳞状细胞癌miR的生物信息学挖掘与分析

樊丽娜，胡雪刚，邱在玲，吕红兵，周文土，傅 升

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是最常见的头颈部鳞状细胞癌，其局部浸润和淋巴结转移率很高，5年生存率为40%～50%［1－2］。因此迫切需要深入探索 OSCC的分子特征，寻找新的靶向治疗策略。

微小RNA（microRNA，miR）是一类内源性小分子非编码RNA分子（18～25个核苷酸），能够与靶mRNA特异性结合，从而降解或抑制mRNA的蛋白质翻译［3］。miR在细胞发育、分化、增殖、细胞周期调控、细胞凋亡和代谢等多个生物学过程中发挥重要作用［4－7］。但是，目前缺乏对 OSCC中 miR表达谱的全面和系统的分析。本研究使用癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库发布的OSCC miR高通量数据来筛选人OSCC与正常组织之间的差异表达miR，并进行其靶基因的预测和GO功能富集分析。

1 材料与方法

1.1 TCGA 中 miR 数据集 从 TCGA（http：／／cancergenome.nih.gov／）数据库下载人 OSCC的组织样本和正常组织样本的miR的表达数据，使用Illumina HiSeq系统检测miR的表达水平，作为TCGA的第3阶段数据，提取标准化miR数据，去除零表达数据。

1.2 筛选差异表达的miR 使用R软件的edger函数筛选差异倍数＞2、P＜0.05条件下正常口腔组织样本和OSCC组织样本之间的差异表达miR，绘制OSCC与癌旁组织差异miR火山图，选取其中差异倍数＞10，P＜0.01的miR进行热图绘制。

1.3 差异表达miR靶基因预测与筛选 使用TargetScan软件预测差异 miR靶基因［8］。运用Venny工具进行集合，获取与OSCC相关差异miR的共同靶基因。

1.4 差异表达miR靶基因的GO功能富集分析采用 DAVID（https：／／david.ncifcrf.gov／home.jsp）在线工具对集合得到差异miR的共同靶基因进行GO功能富集分析［9］，P＜0.01为差别有统计学意义。

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0与 GraphPad Prism 7进行统计学处理。OSCC与癌旁组织的miR表达比较采用非配对t检验。P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 样本间miR表达数据 根据筛选条件下载的389个样本共有1 599个miR表达谱，包括44个正常组织样本和345个OSCC组织样本。

2.2 OSCC与癌旁组织间差异miR的筛选 在正常组织样本和OSCC组织样本之间共有402个差异miR（差异倍数＞10，P＜0.05），其中表达上调的有250个，表达下调的有152个。通过上述分析结合t检验，绘制OSCC组织样本及癌旁组织样本间差异miR火山图（图1），其中差异倍数＞10，P＜0.01的miR共17个（6个下调，11个上调）（图2），对这17个差异miR进行聚类热图绘制（图3）。

图1 口腔鳞癌和癌旁组织二者差异miR火山图Fig 1 The volcano map between oral squamous cell carcinoma and adjacent tissues of differential miR

2.3 差异miR靶基因预测及筛选 应用靶基因预测网站对差异miR的靶基因进行预测，筛选得到差异miR及其预测靶基因数目（表1）。利用Venny工具对预测的靶基因进行集合，获取OSCC差异miR的共同靶基因564个，其中上调的差异miR有561个共同靶基因，下调的差异miR有3个共同靶基因（图4）。

图2 口腔鳞癌和癌旁组织间17个显著差异表达miRFig 2 17miR were expressed differentially between oral squamous cell carcinoma and adjacent tissues

图3 口腔鳞癌和癌旁组织间17个显著差异表达miR热图Fig 3 Heatmap of differentially expressed seventeen－miR between oral squamous cell carcinoma and adjacent tissues

图4 差异miR靶基因的Venn图Fig 4 Venn diagrams of differential miR target genes

2.4 靶基因的GO功能富集分析 通过GO注释描述得到15个基因的GO细胞组分、22个基因的GO分子功能及93个基因的GO生物学过程的注释信息（图5）。结果显示，差异表达的基因主要分布在细胞外膜、细胞器膜、突触等，参与前体miR过程，正调控大分子生物合成过程，RNA过程，蛋白酶参与细胞蛋白降解过程、正调控细胞增殖过程，发挥蛋白结合、RNA结合、钙离子结合、金属离子结合、转换生长因子受体结合、结构活性分子等功能（表2）。

3 讨 论

过去几十年，已有大量的基础和临床研究揭示了OSCC的形成、进展和潜在机制，而大多研究集中在单个基因或者单一队列。目前，癌症的早期诊断和疾病进展的检测对于有效治疗OSCC和获得理想的临床效果至关重要。因此，需要进一步对OSCC的生物标志物和治疗靶点进行研究，以便OSCC的早期诊断、病理鉴定、治疗和监测。

图5 靶基因的GO功能富集分析Fig 5 Enrichment of functions of the target genes was conducted by GO

表1 口腔鳞癌中差异miR及其预测靶基因数目Tab 1 Differential miR and their target genes in OSCC

本研究使用来自TCGA数据库提供的数百个高通量的miR表达谱数据鉴定正常组织样本与相应的肿瘤组织样本相关的基因突变和失调，也有一些研究使用TCGA数据对现有的生物标记物进行独立验证［10－12］。miR作为非编码RNA的家族成员参与基因水平的调控，因为其在检测人类各种癌症时表现出的稳定性和便利性，已被公认为重要的干预靶标和预测工具［13－14］。大量研究证实，miR 在OSCC中具有致癌或抑癌作用。Lin等表明，OSCC患者血浆中的miR－24表达水平显著高于对照［15］；Hung等研究证实，血浆中miR－146a水平升高对OSCC有诊断价值，且通过靶向调控IRAK1、TRAF6和NUMB基因增强致癌性［16］。

表2 差异表达基因的GO分析Tab 2 GO analysis of differently expressed genes

在本研究中，笔者整合了来自TCGA中大量的高通量数据，利用生物信息学方法对这些数据进行深度分析，筛选出显著差异表达的miR共17个（6个显著下调，11个显著上调）。Xie等研究表明，miR－375是影响肝癌患者生存期的独立因素，其低表达与肝癌的发生、发展密切相关，可作为指导肝癌治疗和预后的生物标志物［17］。本研究结果与之一致。Siow等证实，miR－375的低表达与OSCC的晚期病变、肿瘤大小和侵袭模式显著相关，提示它在OSCC的发生中起重要作用［18］。Hou等的研究也证明，miR－196b在OSCC中的表达水平显著高于相邻的正常组织样本，其高表达可促进口腔癌细胞的迁移和侵袭能力，而沉默miR－196b的表达可抑制口腔癌细胞的体外迁移和侵袭，miR－196b可以作为OSCC潜在的预后标志物或治疗靶标［19］。其他差异表达miR大部分都与肿瘤有着密切的关系［20－23］。因此，推测筛选出的差异表达miR或许可作为OSCC的诊断生物标志物及治疗靶标。

本研究对差异miR靶基因进行GO注释富集分析时发现，靶基因显著富集离子，特别是钙离子的运输。Ca2＋可通过激活或抑制细胞信号通路，从而调控多种细胞生物过程，许多Ca2＋介导的信号通路参与肿瘤侵袭或转移过程［24］。已有研究报道，一些Ca2＋通道或Ca2＋泵的异常表达可能与肿瘤的发生有关。Gonzales等研究证实，TRPV1通道在OSCC中表达，且TRPV1拮抗剂能够有效抑制OSCC细胞在体内生长［25］；Saito等表明，PMCA1的下调与OSCC的进展显著相关，TRPM8在前列腺癌中高表达，而SERCA3在结肠癌中表达下调［26］。此外，功能注释结果同样表明，差异表达的基因主要分布在细胞膜、细胞器膜等与细胞生物学活动密切相关的部位，参与前体miR合成、细胞蛋白降解、蛋白激酶合成等生物过程，发挥与RNA结合、钙离子结合、转换生长因子受体结合等涉及发育和转录的分子功能。

综述所述，本研究利用信息生物学方法筛选出hsa－miR－105－1、 hsa－miR－105－2、 hsa－miR－767、hsa－miR－1269b、hsa－miR－548f－1、hsa－miR－1269a、hsa－miR－885、hsa－miR－375、hsa－miR－135a－2等11个在OSCC组织样本中显著差异表达的miR，这些差异miR或许可作为OSCC潜在的生物标志物，为OSCC患者的诊断或靶向治疗研究提供重要的实验依据。