荧光金纳米簇的合成及用于乳制品中三聚氰胺的检测

晋晓勇， 张慧佳， 官菊芳， 彭 娟

(宁夏大学化学化工学院，宁夏银川 750021)

纳米材料因其具有独特的物理化学、光学及电学性质而备受关注[1 - 2]。贵金属纳米簇在生物成像[3]、催化[4]及化学传感器[5]方面的应用十分广泛。金纳米簇(AuNCs)由于其相对简便的制备方法，超小的尺寸，较强的荧光和生物相容性以及高稳定性成为主要关注对象。合成荧光AuNCs的方法中一般都使用具有生物相容性的还原剂或者稳定剂，比如蛋白质和多肽，其中包含硫醇、氨基及羧基，具有高度亲和力，可以将金离子还原成原子[6]。蛋白质在合成AuNCs的过程中也具有举足轻重的地位[7]。到目前为止，多种蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)[8]、胰岛素[9]、辣根过氧化物酶[10]、胃蛋白酶[11]、乳铁蛋白[12]及溶菌酶[13]等都被当作模板用来合成AuNCs。为了得到具有较强荧光的纳米簇，一般都在相对较高的pH和温度下来制备，但这会导致蛋白质失去生物活性。因此，寻找一种简便并具有强烈荧光及高稳定性的AuNCs合成方法是当务之急。

本文采用水热法制备了以胆酸钠为稳定剂与还原剂的具有强烈蓝色荧光的AuNCs。胆酸钠是一种表面生物活性剂，它具有部分亲水及部分亲油性、化学性质不同的官能团、结构钢性、价格低廉等特点，因此胆酸钠是制备AuNCs的理想模板。AuNCs的平均直径为4.2 nm，能发射明亮的蓝色荧光，稳定性高。采用AuNCs的荧光增强现象来检测乳制品中的三聚氰胺，AuNCs的荧光强度与三聚氰胺的浓度的对数呈良好的线性关系，并呈现出较宽的检测范围与较低的检测限。荧光光度法检测乳制品中的三聚氰胺是一种简便、快速、灵敏度很高的检测方法，在实时检测应用中也具有较大潜力。

1 实验部分

1.1 仪器与条件

JEOLJEM-2010型高倍透射电子显微镜(日本，JEOL公司)，加速电压300 kV。将粉末样品放入无水乙醇中，超声分散后滴至微栅上；Rigaku D/Max 2550型X射线粉末衍射仪(日本，日立公司)，Cu靶，λ=0.154 nm，电压为50 kV，管电流200 mA，扫描速度10°/min；TENSOR-27型傅里叶变换红外光谱仪(德国，布鲁克公司)，测试时光谱纯KBr作为背底；F-7000荧光分光光度计(日立,高新技术有限公司)，激发光的狭缝宽度为5 nm，发射光的狭缝宽度为10 nm，扫描电压为400 V。

1.2 试剂

HAuCl4·4H2O、三聚氰胺、胆酸钠(NaC)，均购买于阿拉丁试剂公司。试剂均为分析纯。不同浓度的三聚氰胺用40.0 mmol/L的B-R缓冲溶液(pH=7.0)配制。实验用水为艾柯实验室专用超纯水。

1.3 AuNCs的合成

将11.6 mL 1.0% HAuCl4水溶液与8.0 mL的0.0092 g·mL-1NaC水溶液混合，搅拌均匀后，用1.0 mol/L NaOH溶液调节pH为12.0，持续搅拌10 min，在180 ℃反应8 h，得AuNCs分散液。

1.4 三聚氰胺的测定

50.0 μL AuNCs与不同浓度的三聚氰胺溶液混合，搅拌均匀，用pH=7.0的40.0×10-3mol/L B-R缓冲溶液定容至3.0 mL，反应40 min后测量荧光强度，激发波长：365 nm，发射波长：390～800 nm。

2 结果与讨论

2.1 AuNCs的表征

从图1(A)的AuNCs透射电镜(TEM)照片中可看出，合成的AuNCs其分散性好且无任何粘着团聚现象，颗粒大小均一，其平均粒径为4.2 nm(图1(B))。图1(C)为NaC与AuNCs的X射线衍射(XRD)图的对比图。图中曲线a为NaC在17.0°对应一个衍射峰，而在曲线b中也可以看到，由此判断当以NaC为模板制备AuNCs时，NaC起到良好的模板作用，且其晶体结构与金的面心立方结构是吻合的。图1(D) 为NaC与AuNCs的红外(IR)光谱图。NaC的特征峰在3 420 cm-1(υO-H)和1 620 cm-1(υC=O)，从曲线b中可以看出AuNCs与NaC的图谱相似，可以观察到O-H与C=O对应的3 450 cm-1和1 662 cm-1。这就很好的证明AuNCs的表面含有-OH和-COOH官能团，而且在以NaC为模板制备AuNCs时，NaC通过共价键结合在AuNCs表面。

图1 (A)AuNCs的透射电镜(TEM)图(插图为高分辨电镜图)；(B)AuNCs的尺寸分布图；(C)NaC和AuNCs的X射线衍射(XRD)图；(D)NaC和AuNCs的红外(IR)光谱图Fig.1 (A)TEM image of AuNCs(Inset is the HRTEM image of AuNCs)；(B)Size distribution histogram of AuNCs；(C)XRD of sodium cholate and AuNCs；(D)IR spectra of sodium cholate(a) and AuNCs(b)

图2A为在不同激发波长下AuNCs的发射光谱。考察了激发波长在300～540 nm范围内AuNCs的荧光发射。由图可知，随着激发波长的逐渐增大，荧光强度也逐渐增强。当激发波长为360 nm时，其荧光强度达到最强，继续增大激发波长时，其荧光强度则逐渐减弱。因此，360 nm为后续实验中AuNCs的激发波长。与此同时，可观察到荧光发射光谱随着激发波长的逐渐增大发生红移现象。图2B为AuNCs的荧光激发与荧光发射光谱图。激发波长为365 nm，而发射波长为481 nm，这也证实了在紫外灯照射下观察到的AuNCs呈蓝光。

图2 (A)不同激发波长下AuNCs的荧光发射光谱图；(B)AuNCs的荧光激发与发射光谱图Fig.2 (A) Fluorescence spectra of AuNCs at different excitation wavelengths (λex);(B) Fluorescence emission and excitation spectra of AuNCs

2.2 荧光增强现象

图3 AuNCs体系中有无三聚氰胺的荧光光谱图Fig.3 Fluorescence spectra of AuNCs(a) before and(b) after adding melamine.

从图3可以看出，当体系为AuNCs时，其荧光强度为图中曲线a所示，而当向体系中加入7.5×10-11mol/L的三聚氰胺时，其荧光强度增强(曲线b)。其主要的原理：当向AuNCs溶液中加入三聚氰胺时，AuNCs会与三聚氰胺发生相互作用，即AuNCs表面包被NaC，说明AuNCs表面含有羧基官能团，而羧基会与三聚氰胺的氨基形成氢键，从而改变其表面状态，产生荧光增强的现象。

2.3 测定条件的优化

考察了实验条件，如溶液的pH、温度、AuNCs的用量和反应时间对三聚氰胺荧光检测的影响。由图4A可知，在pH范围为3.0～11.0，随着pH的逐渐增大，AuNCs-三聚氰胺体系的荧光强度呈增加趋势，当pH增大到7.0时，荧光强度达到最大，再继续增加体系pH时，荧光强度值趋于稳定。

从图4B可以看出，反应时间为10～60 min，随着反应时间的逐渐增加，AuNCs-三聚氰胺体系的荧光强度比值(F/F0)逐渐增大，当反应时间到40 min时，(F/F0)值处于缓慢增加的趋势，再延长反应时间到50甚至60 min时，体系的荧光强度也没有明显增强。从图4C中可以看出，随着AuNCs的浓度逐渐增加时，体系的荧光强度是逐渐增大的，即[(F-F0)/F0]值逐渐增大，当AuNCs的浓度为0.16×10-3mol/L时，[(F-F0)/F0]值趋于稳定，继续增大AuNCs的浓度对体系中荧光增强现象并无明显影响。从图4D可以看出，当温度为25 ℃时，[(F-F0)/F0]值最大，随着温度增加到37 ℃和50 ℃时，AuNCs-三聚氰胺体系的荧光强度逐渐降低，即[(F-F0)/F0]值逐渐减小。综上所述，检测三聚氰胺的最优条件为：pH为7.0，反应时间为40 min，AuNCs的浓度为0.16×10-3mol/L，反应温度为25 ℃。

图4 pH值(A)、反应时间(B)、AuNCs的量(C)和反应温度(D)对AuNCs三聚氰胺体系荧光强度的影响Fig.4 Effect of pH(A)、reaction time(B),the amount of AuNCs(C) and reaction temperature(D) on the fluorescence intensity of AuNCs-melamine system

2.4 标准工作曲线

基于对标准工作曲线的考察可知，AuNCs的荧光强度随着三聚氰胺浓度对数的增加而增强。从三聚氰胺浓度的对数与[(F-F0)/F0]的工作曲线，得到线性回归方程为：[(F-F0)/F0]=2.0220+0.0187logc，相关系数为0.9925，检测限为2.30×10-9mol/L。与文献报道的三聚氰胺的检测方法[15 - 20]比较，本文所建立的方法表现出更宽的线性范围和更低的检测限。

2.5 选择性

2.6 实际样品测定

在此基础上，采用标准加入法对实际样品进行了测定。选取超市售的三种牛奶(1#～3#) 与两种奶粉(4#～5#)，其主要测定结果如表1所示。从结果可知，通过荧光光谱法检测实际样品中的三聚氰胺具有较高的重现性，因此这种简便快捷的方法可以作为检测乳制品中三聚氰胺的有效手段。

表1 牛奶与奶粉中三聚氰胺的测定结果(n=3)

3 结论

采用水热法制备了较强蓝色荧光性能和良好的水分散性的AuNCs。三聚氰胺的加入会产生AuNCs的荧光增强现象，基于该原理发展了一种荧光法来检测三聚氰胺的含量。该方法具有检测限低，检测范围宽及选择性高等优点，可应用于乳制品中三聚氰胺的检测。