姜黄素对大鼠环孢素A肾间质纤维化的保护作用

王润秀 汪国平 曹春瑜 李伟松 谢富华

[摘要]目的 探讨姜黄素（Cur）对环孢素A（CsA）而致的大鼠肾间质纤维化的保护作用及其可能的分子机制。方法 将18只SD大鼠随机分为对照组（Ctrl组，n=6）、CsA组（n=6）和CsA+Cur组（n=6），分别给予橄榄油、CsA、CsA联合Cur处理。通过测量大鼠的体重、取血测尿素氮和肌酐、肾组织病理学检查等指标观察Cur对动物肾间质纤维化的改善作用。通过检测大鼠肾组织超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量反映其ROS水平。采用分子生物学方法检测肾组织转化生长因子-β（TGF-β）的表达情况。结果 CsA组动物相对于Ctrl组，体重下降（P<0.05），血尿素氮和肌酐水平显著上升（P<0.05），肾组织TGF-β表达上调（P<0.05），ROS水平上升，病理学表现为轻度间质纤维化，但同时给予Cur可以在一定程度上缓解上述表现。结论 Cur对CsA而致的大鼠肾间质纤维化具有一定的保护作用，其分子机制可能是降低体内ROS水平和下调TGF-β表达。

[关键词]姜黄素；环孢素A；肾间质纤维化

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章編号] 1674-4721（2018）5（b）-0009-04

Protective effect of Curcumin on the renal interstitial fibrosis of rat by Cyclosporin A

WANG Run-xiu1 WANG Guo-ping1 CAO Chun-yu1 LI Wei-song2 XIE Fu-hua3

1.Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China；2.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China；3.Experimental Teaching Center for Analysis and Testing，Gannan Medical University，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China

[Abstract]Objective To investigate the protective effects of Curcumin （Cur） on the renal interstitial fibrosis induced by CsA and reveal the underlying molecular mechanisms.Methods 18 SD rats were randomly divided into control group （Ctrl group，n=6），CsA group （n=6） and group CsA+Cur group （n=6） and the above-mentioned groups was treated with olive oil，CsA and CsA combined with Cur respectively.The effect of Cur on renal interstitial fibrosis in rats were observed by measuring body weight，blood urea nitrogen and creatinine，and histopathological examination.The level of ROS was detected by detecting SOD activity and MDA content in rat kidney tissue.The expression of transforming growth factor beta （TGF-β） in renal tissue was detected by molecular biology.Results Compared with ctrl group，weights of rats in CsA group decreased obviously （P<0.05），and the level of blood urea nitrogen and creatinine increased significantly （P<0.05），and the expression of TGF-β increased significantly （P<0.05）.The level of ROS increased， and the pathological findings were mild interstitial fibrosis.However，giving Cur at the same time could alleviate the above symptoms to some extent.Conclusion Cur has a some protective effect on the renal interstitial fibrosis which induced by CsA，and its molecular mechanism may be down-regulating the expression of TGF-β and the level of ROS.

[Key words]Curcumin；Cyclosporin A；Renal interstitial fibrosis

环孢素A（CsA）在各种肾脏疾病如难治性肾病综合征、自身免疫性疾病、各种器官移植或骨髓移植术后应用广泛，它能显著延缓慢性肾脏病的进展，改善患者的生活质量并延长生命[1-5]。然而，长期和广泛使用CsA却会所造成肾脏的慢性结构性损害即肾间质纤维化[6-7]。不过，近来有研究表明，从姜黄中提取的酚类物质姜黄素（curcumin，Cur）具有清除氧自由基（reactive oxygen species，ROS）、抗纤维化、抗细胞增殖和抗炎等作用，不仅对缺血再灌注肾损害、氧化应激诱导的肾损害等均具有很好的保护作用，而且长期应用无明显毒副作用[8-10]。超氧化物歧化酶（SOD），广泛存在于动植物组织细胞中，是重要的生物抗氧化系统。丙二醛（MDA）是生物体内氧自由基作用于脂质的代谢产物，检测组织中SOD活性和MDA水平可间接反映其ROS水平的高低[11-12]。本研究探讨Cur是否对CsA引起的肾间质纤维化具有保护作用及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取SD大鼠，共18只，购自赣南医学院实验动物中心，平均体重约300 g，雌雄各半，饲养于标准环境，自由进水进食。

1.2 药品与试剂

橄榄油：Bellina蓓琳娜牌，购自普通超市。CsA胶囊：50 mg/粒，华北制药股份有限公司，H10960008，以橄榄油稀释成相应浓度灌胃给药。姜黄素：国药集团，DMSO助溶后以橄榄油稀释成相应浓度灌胃给药（DMSO浓度<0.2%）。SOD活性和MDA含量检测试剂盒购自索来宝生物有限公司。RNA提取试剂Trizol购自天根生物科技有限公司。引物合成于上海生工生物工程有限公司。anti-TGF-β和anti-Actin抗体购自美国SantaCruze公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组、药物处理和指标检测 18只SD大鼠购进并饲养1周后随机分为3组：Ctrl组6只，以橄榄油 30 mg/（kg·d）连续灌胃 24 d；CsA组6只，以CSA 30 mg/（kg·d）连续灌胃24 d；CsA+Cur组6只，同时以CSA 30 mg/（kg·d）和姜黄素200 mg/（kg·d）连续灌胃24 d。每次给药前对大鼠的体重进行称量，并将每隔3 d的数据绘制成动物体重变化图；给药结束后1 d采集大鼠尾静脉血清采用全自动生化分析仪测定血清尿素氮和肌酐水平。

1.3.2 肾组织病理学检测 给药结束后脱颈椎处死所有动物，将肾脏摘下后，去除包膜，长轴方向对切，取部分组织行4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，切片厚 4 μm。切片常规行常规染色，光镜观察。染色切片用高清晰度彩色医学图文分析系统进行分析。

1.3.3大鼠肾组织SOD活性及MDA含量检测 称取适量大鼠肾组织，按每0.1 g加1 ml组织提取液制成组织匀浆，测定组织蛋白浓度（Cpr）后严格按照各试剂盒说明书的方法进行黄嘌呤氧化酶法测定组织SOD活性，硫代巴比妥酸法测定组织MDA含量。按下列公式计算组织SOD活性和MDA含量：SOD活性（U/mg prot）=11.11×稀释倍数×[（A560空白管-A560测定管）/A560测定管]÷Cpr；MDA含量（nmol/mg prot）=25.8×（A532-A600）÷Cpr。

1.3.4大鼠腎组织分子生物学检测 用药结束后，各取部分肾组织剪成2小份，液氮速冻。其中1份采用Trizol法提取组织RNA，逆转录后行实时定量PCR检测转化生长因子-β（TGF-β）mRNA表达情况，TGF-β上下游引物序列分别为5′-GTAACGGAGTGGTGCGCCAA-3′和5′-TTGCACTTCATCCGCGTCTAGA-3′；以GAPDH作为内参基因，其上下游引物序列分别为5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′和5′-CCAAAG TTGTCATGGATGACCT- 3′。另一份称重后加液氮在冰上研磨成粉末，加入RIPA裂解液（含cocktail）冰上裂解30 min，4℃ 12 000 r/min，离心10 min，取上清100℃变性10 min，各组任选2个样品蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转膜，脱脂牛奶封闭，4℃孵育抗体过夜，洗膜后孵育二抗，增强化学发光（enhanced chemilumine-scence，ECl）显色曝光。

1.4 统计学方法

为减小观察误差，采用3次测量取平均值作为最终观测值的方法。数据采用SPSS 19.0软件包进行统计学分析，计量资料采用单因素方差分析（one-way ANOVA），并用SNK法进行两两比较，检验水准（α）=0.05。

2 结果

2.1 Cur对大鼠体重和肾功能的影响

2.1.1体重的变化 CsA组大鼠在使用CsA后第4天开始直至给药结束期间，其体重相对于Ctrl组和CsA+Cur组均有所下降，且差异有统计学意义（P<0.05），但CsA+Cur组大鼠的体重变化相对于正常组，差异无统计学意义（P>0.05）（图1）。

2.1.2血尿素氮和肌酐的变化 给药结束后，CsA组大鼠的尿素氮和血肌酐相对于Ctrl组和CsA+Cur组显著上升，且差异均有统计学意义（P<0.05），而CsA+Cur组大鼠的尿素氮和血肌酐相对于正常组，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

2.2 大鼠肾脏组织病理学变化

Ctrl组大鼠肾组织结构正常，CsA组可见肾小球毛细血管袢开放减少，近曲小管上皮细胞细胞水肿，偶可见空泡变性和溶解，坏死，小管轻度萎缩。间质单个核细胞散在或灶性浸润，有轻度肾间质纤维化。而应用姜黄素保护组即CsA+Cur组的上述病变均有所减轻。

2.3 大鼠腎组织SOD活性及MDA含量

与Ctrl组比较，CsA组的大鼠肾脏组织中SOD活性下降和MDA水平升高，即组织中ROS水平升高（P<0.05），而给予Cur可降低动物肾组织中的ROS水平（表2）。

2.4 大鼠肾组织TGF-β表达的检测

CsA组大鼠肾组织TGF-β mRNA表达量相对于Ctrl组和CsA+Cur组显著上升，且差异有统计学意义（P<0.05），而CsA+Cur组大鼠肾组织TGF-β mRNA表达量相对于正常组，差异无统计学意义（P>0.05）（图2）。

免疫印迹结果：CsA组大鼠肾组织TGF-β 蛋白表达量相对于Ctrl组和CsA+Cur组显著上升，且差异有统计学意义（P<0.05），而CsA+Cur组大鼠肾组织TGF-β 蛋白表达量相对于正常组，差异无统计学意义有（P>0.05）（图3）。结果表明：蛋白水平的变化与上述mRNA水平的变化基本吻合。

3讨论

CsA 导致慢性肾纤维化发生的因素较多，其发生机制也较复杂。①CsA可直接或间接促进促纤维化因子如TGF-β[13-14]、活性ROS[15-16]、血管内皮生长因子（VEGF）[17]、单核细胞超化蛋白-1（MCP-1）[18]和骨桥蛋白（OPN）[19]等的表达上调。②CsA可激活肾素-血管紧张素系统（RAS），从而改变肾脏血液动力学[20]。③肾小管上皮细胞转分化（EMT）及内皮素的产生过多、Toll 样受体（TLR）及上皮细胞钠通道异常等因素也参与了CsA 慢性肾纤维化的发生[5，15，21]。

然而，在上述众多因素中，TGF-β和ROS扮演了非常重要的角色。TGF-β是最强的致纤维化因子之一，在组织器官纤维化过程中有重要作用。TGF-β主要通过 Smad 信号通路发挥生物学效应：促进胶原以及纤维连接蛋白、层黏蛋白等的表达，导致细胞外基质（ECM）的大量产生[13，22]；降低金属蛋白酶表达，抑制 ECM 降解；激活炎症反应，加重肾脏损害；促进EMT的发生，后者可以大量合成ECM。CsA的长期使用还可引起肾血管病变导致肾组织灌注不足，缺氧缺血诱导ROS的产生。反过来，产生的ROS又加重了肾小管上皮细胞的损伤，使其表型改变，发生EMT或凋亡。

Cur是中药姜黄中提取的一种酚类物质，已有研究表明，Cur对缺血再灌注肾损害、糖尿病肾病、氧化应激诱导的肾损害、阿霉素所致的肾损害等均具有保护作用，不仅具有清除ROS、抗纤维化、抗细胞增殖、抗炎等性质，而且长期应用无明显毒副作用。近来有学者发现，Cur能使单侧输尿管梗阻大鼠的TGF-β表达明显减低，能刺激保护胞内酶途径ROS的生成及可上调内皮细胞的ROS的水平，从而具有抗氧化特性。

本研究表明，应用CsA可导致动物体重下降，肾功能减低，肾脏轻度间质纤维化。进一步通过研究发现CsA导致肾脏纤维化与TGF-β表达上调和ROS水平升高有关，这与国内外的研究结果一致。Cur的联合使用则可改善动物的机体状态、保护肾功能和改善肾组织纤维化程度，其可能的分子机制是通过下调 TGF-β表达和降低体内的ROS水平实现的，但具体的信号通路有待进一步研究。

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（收稿日期：2018-03-08 本文編辑：许俊琴）