脊尾白虾E75基因克隆及E75、ECR和RXR在不同蜕皮分期的表达分析*

许 杨 王佳佳 葛倩倩 崔彦婷 马 骊 李 健,2



脊尾白虾基因克隆及、和在不同蜕皮分期的表达分析*

许 杨1王佳佳1葛倩倩1崔彦婷1马 骊1李 健1,2①

(1. 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071； 2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071)

本研究在克隆脊尾白虾()基因(, GenBank No. KY471317)的基础上，探讨了其在蜕皮过程中的作用，同时也探讨了克隆脊尾白虾的蜕皮激素受体基因()和维甲酸X受体基因()在不同蜕皮分期的表达特征。克隆的基因全长为3944 bp，包括2520 bp的开放阅读框(ORF)。该开放阅读框编码一个由839个氨基酸组成的蛋白质，分子量为92.307 kDa，理论等电点为7.48。EcE75蛋白包含1个C4锌指结构，1个配体结合结构域，并且有1个明显的跨膜螺旋。基因在进化上具有一定的保守性，与甲壳动物聚为一支，与三疣梭子蟹()、黑背地蟹()、凡纳滨对虾()、中国明对虾()等亲缘关系最近。基因在脊尾白虾的各组织中均有表达，其中，眼柄中的表达量最高，卵巢次之。在不同蜕皮分期中，与、的表达规律基本一致，生殖蜕皮前期和后期表达量都比生长蜕皮高。生长蜕皮和生殖蜕皮因为卵巢发育而存在明显不同，蜕皮激素对卵巢发育的刺激作用，通过、和基因的表达上调可以体现出来。对、和基因在不同蜕皮分期的表达研究，为了解虾蟹类蜕皮机制提供了参考信息。

脊尾白虾；；；；蜕皮期

蜕皮贯穿甲壳动物的整个生活史，与其生长、发育和繁殖息息相关。蜕皮主要受互为拮抗的Y-器官分泌蜕皮激素(MH, 蜕皮甾类)和眼柄内X-器官窦腺复合体分泌蜕皮抑制激素(MIH)影响。蜕皮激素是调控甲壳动物蜕皮及变态发育的重要激素，它的活性形式是20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)。在昆虫体内，蜕皮激素受体(Ecdysteroid receptor, ECR)与超气门蛋白(Ultraspiracle, USP)形成异源二聚体，在甲壳动物体内，ECR与维甲酸X受体(Retinoid X receptor, RXR)形成异源二聚体(Yao, 1994; Verhaegen, 2011)。这些二聚体与20E结合后形成的受体复合物直接激活E75等蜕皮激素早期应答因子，形成初级应答反应(Riddiford, 2003; Thummel, 2002)。早期应答因子诱导表达的蜕皮激素次级应答基因级联放大蜕皮激素信号，对蜕皮、变态、生殖等生理过程起调控作用(Dubrovsky, 2005)。在昆虫中，基因首先在果蝇(Drosophilidae)中分离得到，Crossgrove等(2008)研究表明，对果蝇的蜕皮、变态及成虫雌蝇的卵室发育有重要作用。果蝇存在和三种亚型，突变使幼体发育过程中蜕皮激素水平降低，导致发育迟缓、蜕皮缺陷等现象(Bialecki, 2002)。突变对生长发育和繁殖无明显影响，突变导致果蝇在成虫期死亡。在甲壳动物中，首先在刀额新对虾()中分离鉴定，而后又在中国明对虾()、三疣梭子蟹()、凡纳滨对虾()、黑背陆地蟹()和大型蚤()等物种中被分离鉴定(Chan, 1998; Priya, 2010; Qian, 2014; Kim, 2005; Hannas, 2010; Litoff, 2014)。对在甲壳动物蜕皮激素信号转导中的作用研究较少。

学者们对脊尾白虾()的蜕皮相关基因进行了研究，梁俊平等(2015)克隆了基因，并分析其在卵巢和胚胎发育过程中的表达情况。柳飞等(2016)克隆了基因，并分析其在温度、盐度胁迫和蜕皮周期中的表达情况。张美等(2016)克隆了基因，并分析其在pH和氨氮胁迫中的表达规律。而关于脊尾白虾的基因的研究至今尚未见报道。因此，本研究结合脊尾白虾转录组数据库，运用RT-PCR和RACE技术克隆基因cDNA全长，通过荧光定量PCR分析了该基因在脊尾白虾的组织表达分布及在不同蜕皮分期和的表达规律，以比较生长蜕皮和生殖蜕皮的不同，为了解虾蟹类蜕皮机制提供参考信息。

1 材料与方法

1.1 实验材料

脊尾白虾取自山东省日照海辰水产有限公司，均为活力好、大小均匀的健康个体，体长为(5.42± 0.34) cm，体重为(1.58±0.22) g。将实验用虾暂养于200 L的PVC桶中，每桶50尾，暂养海水盐度为31，pH为8.2，水温为24℃，24 h持续通气充氧。每天早晚2次饲喂蛤蜊肉，吸污换水1/3，连续养殖7 d后开始实验。

1.2 实验方法

1.2.1 2种蜕皮的区分及样品处理 未性成熟的脊尾白虾处于生长期，该组实验虾的蜕皮为生长蜕皮。性成熟的实验虾分为卵巢发育虾和抱卵虾，其中，卵巢发育且带有腹蓝者的蜕皮为生殖蜕皮。根据中华锯齿米虾()(王战芳, 2014)和凡纳滨对虾(Gao, 2015)的方法进行蜕皮分期，分为蜕皮间期(C期)、蜕皮后期(软皮期，AB期)、蜕皮前期(D期，取自特征明显的D2亚期)。实验用虾暂养1周后，挑选活力好、无残缺的个体，用解剖剪剪取尾节末端，置于倒置显微镜，观察分期并拍照。将确定分期的脊尾白虾每尾虾取0.1 ml血与0.1 ml预冷的抗凝剂混合，于4℃下5000 r/min离心10 min，弃上清液后加入1 ml Trizol，然后，再采集肝胰腺、鳃、肌肉、肠、胃、眼柄、大颚器、表皮、外壳、腹神经节、卵巢和心共12种组织。液氮研磨后，称取50 mg样品，置于无RNA酶离心管中，并加入1 ml Trizol，震荡混匀后，置于–80℃冰箱保存。每个平行取3尾，每个蜕皮分期共3个平行。

1.2.2 总RNA提取和cDNA合成 采用Trizol试剂法提取各组织的总RNA，核酸定量仪(NanoDrop 2000, Thermo)测定纯度，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测浓度及完整性。利用SMARTTMRACE Amplifica- tion Kit (Clontech)合成cDNA模板。

1.2.3基因cDNA全长的克隆 根据实验室脊尾白虾转录组数据和NCBI上Blast的比对结果，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物和(表1)，以1.2.2中合成的cDNA为模板，使用HiFi酶进行基因中间片段的扩增。扩增体系：cDNA模板1 μl，HiFi Buffer 2 μl，dNTP (2.5 mmol/L) 1.6 μl，引物(上、下游)各1 μl，HiFi酶(5 U/ml) 0.2 μl，灭菌水补至20 μl。

PCR反应程序：95℃ 5 min；94℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min；4℃保温。PCR产物经1.0%的TAE琼脂糖凝胶电泳初步检测后，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit (TaKaRa)切胶回收，并纯化检测。切胶回收产物与pEASY-T1载体连接后，将5 μl连接产物转化到50 μl Trans1-T1感受态细胞中。在含AMP、IPTG和X-gal的LB固体培养基中，37℃培养过夜，挑取单一白斑菌落继续培养6 h。菌落PCR鉴定后，将含有目的条带的菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果经NCBI比对，此序列片段与其他物种的基因同源性较高，确定为脊尾白虾的基因序列片段。

根据上述扩增得到的中间片段利用Primer Premier 5.0软件设计3¢和5¢RACE引物E75 3¢RACE和E75 5¢RACE(表1)，用于RACE扩增基因cDNA全长序列。使用Smart Race试剂盒(TaKaRa)进行3´RACE和5¢RACE PCR扩增，扩增体系为3¢/5¢RACE cDNA 0.5 μl，10×Advantage 2 PCR Buffer 2.0 μl，dNTP(10 mmol/L) 0.2 μl，3¢/5¢引物格0.2 μl，50× Advantage 2 Polymerase 0.2 μl，UPM(10×) 1 μl，PCR级H2O 6.9 μl。PCR反应程序为95℃ 3 min；95℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，10个循环，每个循环退火温度降0.5℃；95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 3 min，20个循环；72℃ 10 min；4℃保存。PCR扩增产物的纯化、克隆、测序与基因中间片段的克隆方法相同。

1.3 EcE75基因的生物信息学分析

使用DNAStar软件中的SeqMan程序将测序所得的中间片段和3¢、5¢末端序列进行拼接，得到基因全长。利用ExPASy(http://www.expasy.ch/tools/)和Gene Tool软件预测开放阅读框(ORF)和蛋白质序列。使用Predict Protein和SMART服务器进行蛋白质理化性质预测和功能结构域分析。使用TMpred进行跨膜结构域预测。使用ClustalX和DNAman软件对脊尾白虾和其他物种的E75氨基酸序列进行比对分析，并用MEGA 6.07软件以邻接法(Neighbour- Joining，NJ)构建系统进化树，1000次Bootstrap重复检验进化树的置信度。

1.4 EcE75基因组织表达分析

根据已获得的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计1对特异引物E75RT-F和E75RT-R，并以脊尾白虾18S rRNA为内参基因设计引物18sF与18sR (表1)。利用Real-time PCR检测脊尾白虾不同组织基因的相对表达量。反应体系和程序参考FS Universal SYBR Green Master(ROX)说明书，采用10 μl反应体系。反应程序：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 34 s，40个循环；95℃ 15 s；60℃ 1 min； 95℃ 15 s。实验中每3尾混合作为1个样品，每个样品进行3次重复，数据为3个重复的平均值±标准差，采用2‒DDCt法计算脊尾白虾基因在各组织中的相对表达量。

1.5 EcRXR、EcECR和EcE75基因在不同蜕皮分期的组织表达分析

根据GenBank的基因序列(GenBank No. KU647675)，(GenBank No. KC506600)，(GenBank No. KY471317)，利用Primer Premier 5.0软件分别设计特异引物RXRRT-F、RXRRT-R；EcRRT-F、EcRRT-R；E75RT-F、E75RT-R，并以脊尾白虾18S rRNA为内参基因设计引物18sF与18sR，对生长蜕皮和生殖蜕皮不同分期眼柄中基因的表达进行检测。

表1 研究所用的引物序列

Tab.1 Primers used in this study

1.6 数据处理

实验数据采用平均值±标准差(Mean±SD)表示，使用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan多重比较进行差异显著性检验，<0.05认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 EcE75基因cDNA全长克隆及序列分析

通过RACE技术成功获得基因cDNA序列全长。该基因全长为3944 bp，包括2520 bp的开放阅读框(ORF)，450 bp的5¢非编码区(5´UTR)和 974 bp的3¢非编码区(3¢UTR)。经PredictProtein软件预测，基因编码一个由839个氨基酸组成的蛋白质，分子量为92.307 kDa，理论等电点为7.48，脂溶系数为77.07，亲水指数(GRAVY)为–0.417。经SMART服务器预测，EcE75蛋白包含1个C4锌指结构(位于第32~104个氨基酸之间)、1个配体结合结构域(位于第207~366个氨基酸之间)及6个低组分复杂区域(分别位于第396~408个氨基酸、第419~443个氨基酸之间、第499~514个氨基酸之间、第574~627个氨基酸之间、第685~691个氨基酸之间以及第716~736个氨基酸之间)，具体位置见图1。经TMpred软件预测，基因有1个明显的跨膜螺旋，跨膜方向为由内向外，由第297~313个氨基酸构成，得分为580，预测结果见图2。

虚线下划线表示C4锌指结构区域，方框表示配体结合结构域，小方框(ATG)表示起始密码子，小方框*表示终止密码子，其他下划线表示6个低组分复杂区域

The dotted line represents the C4 zinc finger structure, the box represents the ligand binding domain, the small box (ATG) represents the start codon, the small box * indicates the stop codon, and the underlines represent the 6 low component complex regions

图2 EcE75跨膜螺旋预测

2.2 EcE75蛋白同源性及系统进化树分析

经过多序列比对发现，EcE75蛋白与三疣梭子蟹、凡纳滨对虾、中国明对虾、黑背陆地蟹、刀额新对虾同源性较高，可以证明此序列就是脊尾白虾的E75蛋白(图3)。系统进化树分析表明，EcE75蛋白在进化上具有一定的保守性，与甲壳动物聚为一支，与三疣梭子蟹、黑背陆地蟹、凡纳滨对虾、中国明对虾等亲缘关系最近，相似性分别为79%、79%、78%和78%(图4)。

2.3 EcE75基因组织表达分析

采用RT-PCR方法检测脊尾白虾肝胰腺、鳃、肌肉、肠、血、胃、心、表皮、壳、卵巢、眼柄、大颚器和腹神经节共13种组织中基因的表达情况。结果显示，基因在13种组织中均有表达，眼柄表达量最高，卵巢次之，肌肉和血细胞表达量较低，肝胰腺中最低(图5)。

KY471317;ACF36863.1;AAY89587.2;AGS94407.1;O77245.1;AJT60335.1

2.4 EcRXR基因在不同蜕皮分期的表达分析

基因在不同蜕皮分期的脊尾白虾眼柄中的表达情况如图6所示。生长蜕皮时，的表达量呈逐渐降低的趋势，蜕皮间期显著高于蜕皮前期和后期(0.05)，蜕皮前期和后期差异不显著；生殖蜕皮时，的表达量呈逐渐升高的趋势，蜕皮间期显著低于蜕皮前期和后期(0.05)，蜕皮前期和后期差异不显著；蜕皮间期时，生长蜕皮显著高于生殖蜕皮(0.05)；蜕皮前期和后期时，生长蜕皮显著低于生殖蜕皮(0.05)。

2.5 EcECR基因在不同蜕皮分期的表达分析

基因在不同蜕皮分期的脊尾白虾眼柄中的表达情况如图7所示，生长蜕皮时，的表达量呈逐渐降低的趋势，蜕皮间期显著高于蜕皮前期(0.05)，蜕皮前期显著高于蜕皮后期(0.05)；生殖蜕皮时，蜕皮前期显著高于蜕皮间期和后期(0.05)，蜕皮间期与后期差异不显著；间期时，生长蜕皮显著高于生殖蜕皮(0.05)；前期和后期时，生长蜕皮显著低于生殖蜕皮(0.05)。

图4 脊尾白虾与其他物种的E75蛋白系统进化树

标尺长度表明每个位点发生0.05次置换

The length of the ruler indicates 0.05 replacements at each site

图5 EcE75基因在不同组织中的表达

不同字母代表组织间差异显著(0.05)

Different letters mean significant difference among tissues at 0.05 level

图6 EcRXR基因在不同蜕皮分期的表达

同种蜕皮的不同分期用大写字母表示差异显著(0.05)，不同种蜕皮的同一分期用小写字母表示差异显著(0.05)。下同

Capital letters indicate significant difference among different stages of the same type of molting, while lower case letters indicate significant difference between different types of molting in the same stages. The same as below

图7 EcECR基因在不同蜕皮分期的表达

2.6 EcE75基因在不同蜕皮分期的表达分析

基因在不同蜕皮分期的脊尾白虾眼柄中的表达情况如图8所示。的表达量在生长蜕皮时，蜕皮后期显著低于蜕皮间期和前期(0.05)，蜕皮间期和前期差异不显著；生殖蜕皮时，蜕皮前期显著高于蜕皮间期和后期(0.05)，蜕皮间期与后期差异不显著；蜕皮间期和后期时，生长蜕皮显著高于生殖蜕皮(0.05)，前期时，生长蜕皮显著低于生殖蜕皮(0.05)。

图8 EcE75基因在不同蜕皮分期的表达

3 讨论

本研究首次克隆得到脊尾白虾的基因，该基因全长为3944 bp，包括2520 bp的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框编码839个氨基酸。基因编码的蛋白包含1个C4锌指结构、1个配体结合结构域及 6个低组分复杂区域。氨基酸序列比对结果显示，克隆得到的基因具有E75基因典型的结构域。系统进化树分析表明，脊尾白虾E75在进化上具有一定的保守性，与甲壳动物聚为一支，与三疣梭子蟹、黑背地蟹、凡纳滨对虾、中国明对虾等亲缘关系最近，表明本研究克隆得到的基因确定为脊尾白虾基因。基因在脊尾白虾的13种组织中均有表达，其中，眼柄的表达量最高，卵巢次之。不同物种的组织表达量有差异，如凡纳滨对虾肌肉中表达量最高，眼柄次之(钱昭英, 2014)；三疣梭子蟹眼柄中表达量最高，表皮次之(Xi, 2016)。而脊尾白虾基因在眼柄和卵巢中的高表达，暗示其可能与蜕皮及卵巢发育相关，需要进一步进行功能验证。

眼柄对于甲壳动物蜕皮调控具有重要作用，且和基因在眼柄中都具有高的表达量，因此，本研究检测了不同蜕皮分期和的表达规律。结果显示，与的表达规律基本一致，生殖蜕皮的蜕皮前期和后期表达量都比生长蜕皮高。Lachaise等(1981)和Chan(1995)研究表明，在卵巢的发育过程中，随着卵巢的逐渐成熟，蜕皮激素的浓度随之增加，在产卵前下降，而蜕皮激素的活性形式20E需要结合ECR和RXR形成的二聚体，从而导致和表达量升高。在生殖蜕皮的蜕皮后期表达量高于蜕皮前期，这与Durica等(1996)的研究结果相似，推测可能与卵巢发育有关。基因在生殖蜕皮的表达规律与一致，而生长蜕皮前期，表达量与蜕皮间期表达量差异不显著，与和的表达规律不一致，原因有待进一步研究。生长蜕皮与生殖蜕皮的主要区别在于生殖蜕皮伴随卵巢发育，而本研究中，相较于生长蜕皮，、和在生殖蜕皮的高表达，说明其可能与脊尾白虾的卵巢发育有关。通过对脊尾白虾、和基因在不同蜕皮分期的表达研究，为虾蟹类蜕皮机制及苗种育成提供了参考信息。

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(编辑 马璀艳)

Cloning ofGene and Expression Analysis of,andDuring Different Molting Stages of

XU Yang1, WANG Jiajia1, GE Qianqian1, CUI Yanting1, MA Li1, LI Jian1,2①

(1. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

Based on the cloning of(, GenBank accession number: KY471317), we studied its role in molting and the expression pattern ofandduring different stages of molting. The full-length cDNA ofis 3944 bp long, which contains an open reading frame (ORF) of 2520 bp. The protein encoded byis composed of 839 amino acids. The estimated mass of the deduced amino acid sequence ofis 92.307 kDa, and the calculated theoretical isoelectric point (pI) is 7.48. The ZnF_C4 and the HOLI domains were detected in, and one distinct transmembrane helix was identified. The geneis conserved during evolution. The phylogenetic tree constructed based on E75 sequences showed that EcE75 was clustered with that of the same clade of crustaceans.has the highest homology with,,,andThe tissue distribution analysis showed thattranscript could be detected in all tested tissuesof,and relatively abundant in eyestalk and ovary. The expression pattern of the genes,, andwas consistent during different stages of molting. At the premoult and postmoult stages, the expression of genes of reproductive molting was significantly higher than that of growth molting. The results showed that there was significant difference between the growth and reproductive molting because of the ovary development. Furthermore, it revealed the effect of ecdysone stimulation on ovarian development through the upregulation of expression of the genes,, and. The present study on the expression of the genes,, andat different stages of molting provides a theoretical basis and a scientific ground for further research on the mechanism of molting.

;;;; Molting stage

LI Jian, E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

S917.4

A

2095-9869(2018)04-0110-09

10.19663/j.issn2095-9869.20170328001

* 现代农业产业技术体系专项(CARS-48)、泰山产业领军人才工程项目(LJNY2015002)和青岛海洋科学与技术国家实验室鳌山科技创新计划项目(2015ASKJ02)共同资助[This work was supported by China Agriculture Research System (CARS-48), Program of Shandong Leading Talent (LNJY2015002), and Science and Technology Innovation Project of Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02)]. 许 杨，E-mail: aspenxy@163.com

李 健，研究员，E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

2017-03-28,

2017-04-28

许杨, 王佳佳, 葛倩倩, 崔彦婷, 马骊, 李健. 脊尾白虾基因克隆及、和在不同蜕皮分期的表达分析. 渔业科学进展, 2018, 39(4): 110–118

Xu Y, Wang JJ, Ge QQ, Cui YT, Ma L, Li J. Cloning ofgene and expression analysis of,andduring different molting stages of. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(4): 110–118