蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的肿瘤坏死因子-α基因启动子相关遗传易感性分析

严兴丽 杨学丽

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是各种原因引起的血管破裂，聚集在蛛网膜下腔，根据病因分为自发性和创伤性出血。脑血管痉挛(cerebral vasospasm，CVS)是SAH最严重的并发症，也是影响结局转归因素之一[1-2]。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)是参与炎症反应和特异性免疫应答的重要因子，既往研究结果显示SAH在脑循环中会产生大量TNF-α[3-4]。本研究选择2014年2月-2017年2月就诊于本院的168例SAH患者，比较TNF-α启动子区5个位点SNPs，-238G/A、-308G/A、-857C/T、-863C/A、-1031T/C在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛患者中的频率分布,以探讨TNF-α基因相关遗传易感性和SAH后CVS的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

纳入2014年2月-2017年2月就诊于本院的蛛网膜下腔出血患者168例，均经过CT或脑脊液检查确诊，并记录患者的一般临床资料及Hunt-Hess分级。经颅多普勒和脑血管造影联合诊断脑血管痉挛，因为手术或者介入治疗前为脑血管痉挛发生的高峰期，用经颅多普勒测大脑中动脉和大脑前动脉的血流速度(Vm)，以最高流速Vm≥120 cm/s诊断为脑血管痉挛，<120 cm/s提示无脑血管痉挛[4-5]。脑血管痉挛组与非脑血管痉挛组各84例，其中脑血管痉挛组男39例，女45例，年龄47.6～67.4岁，平均年龄(55.3±6.5)岁；非脑血管痉挛组男38例，女46例，年龄46.3～66.9岁，平均年龄(54.7±6.1)岁。同期选取84例正常成年人作为对照组，男40例，女44例，年龄48.1～68.2岁，平均年龄(55.7±6.3)岁，3组性别、年龄等一般资料比较无明显差异(P>0.05),具有可比性。

1.2 TNF-α基因启动子区基因型及等位基因频率分布检测

首先，从外周血提取基因组DNA，应用聚合酶链反应和序列特异性引物-PCR(SSP-PCR)方法对TNF-α基因启动子区5个位点(-238G A、-308G A、-857C T、-863C A)[6]进行分析，各位点的基本情况见表1。具体操作步骤为(1)对基因片段进PCR扩增，25 μL的扩增体系(聚合酶、模板基因组DNA、缓冲液、MgCl2、引物、dNTPs)；(2)预变性及变性(温度均为94 ℃)；(3)退火：退火温度30 s；(4)延伸：72 ℃延伸30 s，30个循环，然后72 ℃延伸10 min；(5)鉴定PCR产物：用2%琼脂糖凝胶电泳15 min，120 V紫外灯下鉴定；其次用特异性限制内切酶消化PCR产后消化产物用3%琼脂糖凝胶电泳，观察酶切产物鉴定基因型。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 CVS相关临床资料比较

本研究中由5 个位点-238G/A、-308G/A、-857C/T、-863C/A、-1031T/C基因型和等位基因频率为遗传平衡群体。CVS(+)组与CVS(-)组年龄、性别、高血压病史及CT Fisher分级均无明显差异(P均>0.05)，Hunt-Hess分级构成比有明显差异(P<0.05)(表2)。

表1 TNF-α启动子区SNP分型方法

表2 CVS相关临床资料

2.2 TNF-α基因启动子区基因型及等位基因频率分布

3组-238G/A及-863C/A位点的基因型和等位基因有明显差异(P<0.05)(表3)。

2.3 蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛发生的多因素分析

对相关临床资料及多态性等因素作多因素Logistic回归分析发现-238G/A、-863C/A基因型和Hunt-Hess分级为与脑血管痉挛有关的危险因素 (P<0.05)(表4)。

表3 对照组、CVS(-)组与CVS(+)组-238G/A、-308G/A、-857C/T、-863C/A、-1031T/C多态性比较

表4 多因素logistic回归分析

3 讨 论

脑血管痉挛是蛛网膜下腔出血后最常见、最严重的并发症之一，也是影响患者致死率和致残率的主要原因[7]。但是关于蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的发病机制和原因尚不清楚，多数学者认为这是由多因素决定的，常见的比如血管活性物质、炎症反应因子(如TNF-α)[7-8]。本研究对TNF-α基因启动子区的5个SNPs即-238G/A、-308G/A、-857C/T、-863C/A、-1031T/C与SAH后CVS的关系进行了分析，结果显示-238G/A、-863C/A基因型是SAH后发生CVS的易感因素(P均<0.05)。进一步分析显示-238G/A、-863C/A基因型和Hunt-Hess分级为与脑血管痉挛有关的危险因素(P<0.05)。含SNPs的等位基因特异反应元件与反式作用因子的结合情况决定了SNP对于细胞因子的影响情况，其中TNF-α基因-238位在DNA-结合蛋白与启动子的结合区，与启动子的活性密切相关，-863位在核因子(NF-κB)结合序列中，与后者的稳定性密切相关，如果C被A取代，会影响转录[9-10]。

TNF-α在体内往往通过与其受体结合，调节凋亡通路中的蛋白表达，影响平滑肌细胞及内皮细胞的凋亡速度。另外，TNF-α是炎性因子，会激活炎症反应系统，趋使白细胞等向损伤位置移动，破环血管壁完整性，引起局部血管扩张[11]。目前已有研究显示，TNF-α高表达更易发生蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛，这与本研究结果一致，可能与TNF-α参与血管炎症反应等密切相关[12]。

寻找蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的易感基因，并筛查易感人群，对于早期预防、及时诊断和治疗有着十分重要的意义。本研究结果显示-238G/A、-863C/A位点及其基因型是蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的易感基因，但是关于TNF-α基因对于脑血管痉挛的发病机制，尚需扩大样本量，采取多中心研究进一步探讨。