PDGF—BB对UVB诱导的光老化成纤维细胞中ROS的影响

任润健 方磊 贾传龙 赵虎 陈亮 秦登科 周慧敏 毕波

[摘要]目的：探讨PDGF-BB对紫外线诱导的光老化成纤维细胞中ROS的影响及抑制氧化应激的作用特点。方法：利用CCK-8法检查不同濃度PDGF-BB对成纤维细胞增殖活性的影响，筛选治疗最佳浓度；PDGF-BB预处理成纤维细胞48h后，利用UVB体外重复照射构建成纤维细胞光老化模型；利用β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老程度；装载活性氧（ROS）检测探针，利用荧光显微镜、流式细胞技术观察和检测各组ROS的表达。结果：PDGF-BB预处理辐照组（UVB+PDGF-BB组）中β-半乳糖苷酶染色细胞的着色比率低于UVB组，差异有统计学意义（P<0.05）。在UVB诱导的应激性老化中，UVB组ROS表达显著高于正常组（P<0.05）；PDGF-BB预处理辐照组（UVB+PDGF-BB组）ROS表达显著低于UVB组（P<0.05）。结论：PDGF-BB可降低UVB介导的光老化成纤维细胞中ROS的表达，减少氧化应激反应，可在一定程度上缓解光老化进程。

[关键词]光老化；PDGF-BB；成纤维细胞；ROS；UVB

[中图分类号]R758.1 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）05-0109-03

Effect of PDGF-BB on Reactive Oxygen Species in UVB-induced Skin Fibroblasts

REN Run-jian1，FANG Lei1，JIA Chuan-long2，ZHAO Hu1，CHEN Liang2，QIN Deng-ke2，ZHOU Hui-min1，BI Bo1

（1.Department of Clinical Laboratory Medicine；2.Department of Plastic and Aesthetic Surgery，Huadong Hospital Affiliated to Fudan University，Shanghai 200040，China）

Abstract： Objective To explore the effect of PDGF-BB on reactive oxygen species （ROS） in UVB-induced skin fibroblasts and the characteristics of oxidative stress. Methods The effect of PDGF-BB of different dosages on the activity of fibroblasts was detected by CCK-8 assay. After pretreatment of fibroblast 48h with PDGF-BB， the photoaging model was successfully established with UVB in vitro. The senescence degree of cells was detected by the β-galactosidase staining method. ROS test probe was loaded and oxidative stress of fibroblasts was induced by UVB irradiation in vitro and the expression of ROS was measured by fluorescence microscopy and flow cell technology respectively. Results The coloring percentage of the cells stained by beta galactosidase in the PDGF-BB pretreatment group（UVB+PDGF-BB group） was lower than that in the UVB group， the difference was statistically significant（P<0.05）. In UVB induced stress aging， the expression of ROS in UVB group was significantly higher than that in normal group（P<0.05）. The expression of ROS in the PDGF-BB pretreatment group （UVB+PDGF-BB group） was significantly lower than that of UVB group（P<0.05）. Conclusion PDGF-BB can reduce ROS expression in fibroblasts induced by UVB irradiation and decrease oxidative stress， and it could alleviate photoaging in some extent.

Key words： photoaging； platelet derived growth factor BB（PDGF-BB）； fibroblasts； reactive oxygen species（ROS）； ultraviolet radiation B（UVB）

皮肤光老化作为皮肤老化的重要组成部分，严重影响人们的外观和身体健康[1-2]。在其发生发展进程中，紫外线，尤其是波长范围290～320nm的中波紫外线（Ultraviolet radiation B， UVB）成为主要诱因[3]。UVB引起的皮肤光老化主要表现为弹性缺失，皱纹加深，色素沉着，甚至诱发黑色素瘤等[4]。在这一复杂病理生理过程中，成纤维细胞（Fibroblasts， FBs）受到损伤，出现一系列衰老表型，如细胞肥大铺展，β-半乳糖苷酶染色阳性，细胞周期阻滞等。有研究认为UVB诱导活性氧（Reactive oxygen species， ROS）的异常生成，光子能量转化为化学能量所造成的氧化应激是导致光老化的主要机制。血小板衍生因子（Platelet derived growth factor， PDGF）是由两条多肽链组成的二聚体，相对分子质量为28～35KD，主要由成熟的血小板分泌，存在于多种组织中如血小板、骨骼肌细胞、内皮细胞、成骨细胞，是一种促有丝分裂刺激源[5]。同时，PDGF有很强的趋化作用，对骨骼肌细胞、未分化间充质细胞、单核细胞等都有很强的趋化功能。近来有研究发现在星形胶质细胞中，PDGF-BB可抑制自由基活性氧（ROS）产生，保护线粒体超微结构对抗氧化应激，从而发挥其保护作用[6]。然而，PDGF-BB能否改善UVB造成的氧化应激，从而延缓光老化进程尚不清楚。本研究应用此前在体外建立的成纤维细胞光老化模型（Stress-induced premature senescence， SIPS），予以外源性PDGF-BB处理，观察其对SIPS-FBs的生物学作用。

1 材料和方法

1.1 小鼠皮肤细胞的获取：取1～3d新生SPF级C57 BL/6小鼠，乙醚麻醉后浸泡于75%乙醇中8～10min，用灭菌PBS洗去残留乙醇，无菌条件下分离其背部皮肤，留取1cm×1cm皮肤组织，立即置于2%中性蛋白酶中，密封，4℃冰箱过夜；将皮肤取出后分离表皮与真皮，剪碎真皮，置于0.1%胶原酶中，37℃恒温摇床消化2h，待组织团块基本消失可离心，1 500r/min离心5min，收集沉淀；弃去上清，用DMEM+10% FBS制成细胞悬液，吹打均匀后以约2×105/cm2密度接种于培养皿置于常规培养箱中培养；待2～3d后，细胞近80%～90%融合时进行传代，比例约为1：4。

1.2 药物预处理及光老化模型的建立：选用P1代细胞，首先利用含不同PDGF-BB浓度DMEM+10% FBS处理约48h。本研究中，成纤维细胞随机分为4组：正常组（无PDGF-BB预处理，无UVB辐照），PDGF-BB组（PDGF-BB预处理，无UVB辐照），UVB组（无PDGF-BB预处理，UVB辐照），UVB+PDGF-BB组（PDGF-BB预处理，UVB辐照）。随后依据相关文献方法[7]，弃去培养液，覆盖薄层PBS缓冲液，置于UVB灯管（Philips TL 20W/01RS lamp）正下方，打开盖子，进行辐照，照射剂量为120mJ/cm2。辐照完毕后，除去PBS，加入5ml DMEM+1% FBS继续培养，间隔12h照射1次，120s/次，共4次；末次辐照完成后改用DMEM+10% FBS继续培养。

1.3 β-半乳糖苷酶染色：将生长于6孔板中的成纤维细胞吸除培养基，用PBS洗涤后加入1ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室温下固定15min。吸掉固定液，用灭菌PBS洗涤3次，加1ml工作液（现用现配），利用盐酸及氢氧化钠调整pH至6[8]。37℃孵育过夜。普通光学显微镜下观察到胞质呈蓝色者为阳性细胞，表示细胞处于衰老状态。阳性率的计算方法为200倍下随机取10个视野，计算阳性细胞占总细胞数的百分比。

1.4 检测细胞ROS生成：按照DCFH2-DA：DMEM-free serum配比1：1 000制备试剂，加入6孔板中1ml/孔，置于培养箱中37℃孵育20～30min。吸掉培养液，无血清DMEM洗涤3次后，薄层PBS覆盖细胞，置于UVB灯管下，照射1次，剂量为120mJ/cm2，2min后弃去PBS，加入无血清DMEM培养基，30min后置于荧光显微镜下观察，同样的药物处理及辐照后即刻用0.25%胰酶消化细胞，流式细胞仪检测ROS表达。

1.5 统计学分析：采用统计分析软件SPSS 13.0分析结果，所有数据以均数±标准差表示，各组间的比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDGF-BB实验浓度的筛选：使用梯度PDGF-BB浓度的DMEM+10% FBS处理小鼠成纤维细胞，0～8ng/ml PDGF-BB对成纤维细胞活性无影响，且有不同程度促进作用，尤以1ng/ml显著。因此，本次选择1ng/ml的PDGF-BB作为后续细胞处理的药物浓度（见图1）。

2.2 β-半乳糖苷酶染色结果：正常组和PDGF-BB组细胞鲜有染色；UVB组衰老染色主要集中在细胞核周，呈蓝绿色；经过PDGF-BB预处理的辐照组（UVB+PDGF-BB组）中阳性染色的细胞显著减少（见图2），差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 细胞ROS生成检测结果：UVB可导致ROS一过性升高，峰值出现在照射后30min左右。共聚焦荧光显微镜下观察可见，经UVB组细胞的荧光强度强于正常组；与UVB组相比，经过PDGF-BB预处理的辐照组（UVB+PDGF-BB组）中荧光强度明显下降（见图3）。流式细胞仪检测分析显示，与UVB组相比，经过PDGF-BB预处理的辐照组（UVB+PDGF-BB组）中的相对荧光强度的波峰向左回移，ROS水平明显下降（见图4）。

3 討论

活性氧（ROS）是生物体内的氧通过单电子还原产生的化学性质活泼物质，包括过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子自由基（O2·-）、和羟基自由基（·OH）等[9]。低浓度的ROS有助于细胞生理活动的调节，而过量的ROS可氧化脂质、蛋白质等大分子，激活炎性信号通路甚至导致细胞凋亡或变性坏死[3]。ROS半衰期很短，可与DNA、蛋白质和脂质相互作用，造成DNA链断裂和氧化性损伤、蛋白-蛋白交联、蛋白-DNA交联和脂质过氧化等，与癌症、衰老、心血管疾病等疾病密切相关[10]。因此，抑制ROS过表达，维持氧化/还原平衡成为生命科学领域的一项重要课题[11]。

在成纤维细胞光老化模型中，经UVB反复照射，成纤维细胞内氧化还原系统失衡，即反复ROS过量产生，大量消耗细胞内还原物质，最终形成累积性的氧化损伤。有研究表明，细胞内90%的ROS由线粒体产生，而线粒体本身又极易受到氧化攻击，发生线粒体DNA（mtDNA）突变、膜电位下降、膜完整性缺失等，从而形成了恶性循环，加重氧化应激，加速衰老[12]；ROS的聚集亦可诱导DNA氧化破坏与交联，引起复制错误，破坏核苷酸辅酶以及灭活含巯基酶，继而引发转录水平的改变[13]；ROS过表达不利于细胞外基质（Extracellular matrix， ECM）稳态的维持，ROS可激活多种信号通路，抑制酪氨酸磷酸酶，激活多个受体，导致下游的分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases， MAPK）、p38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）等活化[14]，使得核内转录因子AP-1 （Activator protein 1， AP-1）的表达增多，抑制I型胶原前体表达，加强基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases， MMPs）表达，造成ECM相关蛋白分泌减少，破环ECM稳态。而ECM对皮肤肤质好坏具有决定性作用[15]。

PDGF-BB是PDGF家族中活性最强的亚型，可与所有的受体分子（α-受体，β-受体）相结合，与跨膜酪氨酸激酶受体结合后可诱导许多其他细胞内蛋白的酪氨酸磷酸化，介导成纤维细胞趋化、增殖和诱导细胞外基质和基质金属蛋白酶，参与创伤修复、肌腱重塑、溃疡愈合等[16]。PDGF-BB可诱导特异性的生物反应，包括细胞增殖、迁移、基质合成、血管生成和生长因子的释放。其在皮肤愈合，慢性溃疡，肌腱修复，骨折及创伤中的研究和应用逐渐加深和普及。近年来，有研究表明，PDGF-BB具有线粒体保护作用。ROS产生与清除失衡后，线粒体膜电位下降，线粒体DNA突变，电子链传递和正常氧化磷酸化受到干扰，ATP生成减少，细胞走向衰老和凋亡。有研究证实PDGF-BB可通过激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B （Phosphatidylinositol 3 kinase /protein kinase B，PI3K/AKt）信号保护线粒体超微结构，缓解氧化应激。另外PDGF-BB可诱导抗氧化物酶如过氧化氢酶（Catalase，CAT），超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase2，SOD2），谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase 1，GPX1）的产生，有助于清除ROS，恢复细胞氧化/还原平衡[6]。本研究探讨PDGF-BB可否减少UVB诱导的FBs内ROS过表达。实验结果表明，1ng/ml PDGF-BB可有效减少ROS含量，提示其对UVB导致的氧化应激有的一定的拮抗作用。

综上所述，本实验证实了PDGF-BB可减少衰老染色阳性细胞，降低光老化成纤维细胞中ROS过表达，减轻UVB诱导的氧化应激从而缓解UVB对成纤维细胞的损伤。提示PDGF-BB可在一定程度上减缓光老化进程。然而，其对ROS表达抑制的具体机制及对成纤维细胞其他方面的影响，包括细胞周期、胞外基质平衡等需进一步研究。

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[收稿日期]2018-03-12 [修回日期]2018-04-17

编辑/朱婉蓉