复方苦玄参颗粒质量标准初步研究

徐杨峰，聂海英，唐廷崇，彭健波，陶 卿，何家康,*

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005；2.广西兽药制剂工程技术研究中心，广西南宁 530003)

苦玄参为玄参科苦玄参属植物，别名苦草、蛇总管、鱼胆草等[1]，味极苦、性寒，可用于治疗发热、咽喉肿痛、肠胃不适、下痢、蛇咬伤及痈疖等，是清热消炎的良药[2]。苦玄参的主要活性成分为三萜类、黄酮类及苯乙醇苷类化合物等[3]。现代药理学研究表明，苦玄参具有抗菌、消炎、解热、镇痛等功效[4-9]。桃金娘是桃金娘科桃金娘属植物，别名金丝桃、山稔、稔果、水刀莲等，全株供药用，其中，桃金娘根含有三萜类、鞣质类等活性成分，具有理气止痛、利湿止泻、收敛、祛瘀止血及益肾养血等功效[10-11]。

复方苦玄参颗粒是以中草药苦玄参为主要成分，辅以桃金娘根一味中药，经提取加工精制而成的中药复方颗粒制剂。为保证临床疗效及有效控制产品质量，本研究参照《中华人民共和国兽药典》(2015年版二部)[12-13]等，建立了复方苦玄参颗粒中的苦玄参及桃金娘根TLC鉴别方法，并建立了苦玄参苷IA的含量分析方法，为复方苦玄参颗粒质量标准的制定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备 高效液相色谱仪(LC-20A)，日本岛津公司产品；电子分析天平(BP211D)，德国赛多利斯集团产品；超声仪(B3200S-T)，必能信超声有限公司产品；全自动薄层板器(939)，重庆南岸贝尔德仪器技术厂产品；色谱柱(Waters Symmetry C18，5 μm，4.6×250 mm)，美国Waters公司产品。

1.1.2 主要试剂 苦玄参苷IA对照品(批号111745-200501)，中国食品药品检定研究院产品；乙腈、甲醇(色谱纯)、硅胶G(化学纯)、南宁恒鑫生物有限公司产品；乙酸乙酯、甲酸、苯、香草醛、浓硫酸、盐酸、三氯甲烷(分析纯)，南宁蓝天实验设备有限公司产品。

1.1.3 试验药物 3批复方苦玄参颗粒样品(批号20151008、20151015、20151022)、缺苦玄参的阴性样品(批号20150701)、缺桃金娘根的阴性样品(批号20150708)，以上颗粒样品均由广西兽药制剂工程技术研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 鉴别方法

1.2.1.1 苦玄参的鉴别 称量本品适量约5 g，加乙酸乙酯-甲醇(5∶1)混合液25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品提取液；另取缺苦玄参的阴性样品，同法制得阴性样品液；此外，分别取苦玄参对照药材及苦玄参苷IA对照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的药液，作为对照药材及对照品药液。按照薄层色谱法《中华人民共和国兽药典》(2015年版二部)附录[12]试验，吸取上述药液各3 μL点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以50 mg/mL香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

1.2.1.2 桃金娘根的鉴别[13]称量本品适量约5 g，加乙醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取缺桃金娘根的阴性样品，同法制得阴性样品液；此外，精密称取桃金娘根对照药材1 mg，加乙醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，得到浓度为1 mg/mL的对照药材提取液,吸取上述药液各3 μL点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-苯-甲醇-甲酸(15∶15∶4∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。

1.2.1.3 专属性考察 分别配制缺苦玄参、桃金娘根的阴性样品，按标准规定的薄层鉴别方法检测，根据试验结果考察该方法对药材的薄层鉴别是否具备专属性。

1.2.1.4 重复性考察 取3批样品，按标准规定的薄层鉴别方法进行检测，考察该方法的重复性。

1.2.2 含量测定

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry C18(5 μm，4.6×250 mm)；流动相：乙腈-水(35∶65)；检测波长：264 nm；柱温：35℃；流速：1 mL/min；进样体积：10 μL。

1.2.2.2 对照品药液的制备 取苦玄参苷IA对照品适量，精密称定，稀释制成每1 mL约含0.1 mg的药液，即得。

1.2.2.3 供试品药液的制备 称取复方苦玄参颗粒适量，置具塞锥形瓶中，加入600 mL/L甲醇25 mL，密塞，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用600 mL/L的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.2.4 阴性样品液的制备 按标准处方比例，制备缺苦玄参的阴性颗粒样品，再按供试品的制备方法制备阴性样品液。

1.2.2.5 专属性试验 分别取苦玄参苷IA对照品药液、供试品药液、缺苦玄参的阴性样品液按色谱条件测定，考察方法的专属性。

1.2.2.6 标准曲线的制备和线性关系的考察 精密吸取上述对照品药液适量，制成不同浓度对照品药液，按色谱条件进行测定，记录峰面积，以对照品浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归，绘制苦玄参苷IA标准曲线，考察苦玄参苷IA在规定浓度范围内的线性关系。

1.2.2.7 回收率试验 精密称取已知含量的同一批号复方苦玄参颗粒供试品，称取3份颗粒样品，分别加入3个不同浓度的苦玄参苷IA对照品药液各1 mL，平行3份，再按供试品制备方法处理，按标准的色谱条件测定，记录峰面积，按峰面积计算每份样品的苦玄参苷IA含量，分别计算回收率(%)和相对标准偏差RSD(%)。

1.2.2.8 精密度试验 重复性试验：精密称取同一批号复方苦玄参颗粒供试品，平行6份，按1.2.2.3项下方法制备供试品药液，按色谱条件测定，记录峰面积，计算相对标准偏差RSD(%)。中间精密度试验：在同一个实验室于不同时间由不同分析人员用不同设备对样品进行测定，计算其RSD(%)。

1.2.2.9 稳定性试验 取同一批号复方苦玄参颗粒供试品，按1.2.2.3项下方法制备供试品药液，分别在0、4、8、12、16、20、24 h进样10 μL，考察其稳定性。

1.2.2.10 样品测定 按色谱条件方法测定3批复方苦玄参颗粒样品的含量，计算苦玄参苷IA的含量。

2 结果

2.1 定性鉴别结果

2.1.1 苦玄参的鉴别 3批复方苦玄参颗粒(批号20151008、20151015、20151022)，按标准规定的薄层鉴别方法检测，结果显示，在薄层色谱中，3批供试品在与苦玄参苷IA对照品及苦玄参对照药材相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，背景清晰，分离效果好，无干扰，结果易判断，符合薄层色谱系统适用性检验。因此，该项定性鉴别方法对供试品的处理及展开系统的选择是合理的；同法检测缺苦玄参的阴性样品，结果显示,在与苦玄参苷IA对照品及苦玄参对照药材相应的位置无特征荧光斑点(图1)，说明对苦玄参的薄层鉴别具备专属性。

1.苦玄参对照药材；2.阴性样品；3.苦玄参苷IA对照品；4～6.供试样品(20151008、20151015、20151022)

1.Picriafeltarraecontrol;2.Negative sample;3.Standard of picfeltarraenin IA;4-6.Samples (20151008,20151015,20151022)

图1复方苦玄参颗粒中苦玄参鉴别薄层色谱图

Fig.1 The thin layer chromatogram identification ofPicriafeltarraein Compound Kuxuanshen Granule

2.1.2 桃金娘的鉴别 3批复方苦玄参颗粒(批号0151008、20151015、20151022)，按标准规定的薄层鉴别方法检测，结果显示，在薄层色谱中，3批供试品在与桃金娘根对照药材相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，背景清晰，分离效果好，无干扰，结果易判断，符合薄层色谱系统适用性检验，因此，该项定性鉴别方法对供试品的处理及展开系统的选择是合理的；而在实验室配制缺桃金娘根的阴性样品，同法检测，结果显示,在与桃金娘根对照药材相应的位置无特征荧光斑点(图2)，说明对桃金娘根的薄层鉴别具备专属性，可作为标准中桃金娘根的鉴别方法。

1.桃金娘根对照药材；2.阴性样品；3.供试样品(20151008、20151015、20151022)

1.Rhodomyrtustomentosacontrol;2.Negative sample;3-5.Samples(20151008,20151015,20151022)

图2复方苦玄参颗粒中桃金娘根鉴别薄层色谱图

Fig.2 Thin layer chromatogram identification ofRhodomyrtustomentosain Compound Kuxuanshen Granule

2.2 含量测定

2.2.1 系统适应性试验及专属性试验 结果表明，供试品中苦玄参苷IA与相邻峰的分离度良好(均大于1.5)；理论塔板数按苦玄参苷IA色谱峰计算，为14 000(图3)；阴性样品对测定无干扰，说明方法的专属性良好(图4)。

2.2.2 线性和范围考察试验 标准曲线(图5)试验得苦玄参苷IA的回归方程为：y=7 628.4x+16 310，R2=0.999 3。结果表明，苦玄参苷IA在21.08 μg/mL～105.4 μg/mL范围内线性关系良好(图6)。

2.2.3 精密度试验

2.2.3.1 重复性试验 结果见表1。样品中苦玄参苷IA的平均含量为3.18 mg/g，RSD为0.001%,表明仪器的精密度良好。

2.2.3.2 中间精密度试验 结果见表2。样品中苦玄参苷IA的平均含量为3.20 mg/g，RSD为0.001%,表明仪器的精密度良好。

1.苦玄参苷IA

1.Picfeltarraenin IA

图3苦玄参苷IA对照品色谱图

Fig.3 The chromatogram of standard picfeltarraenin IA

图4 阴性样品溶液色谱图

图5 苦玄参苷IA的标准曲线

1.苦玄参苷IA

1.picfeltarraenin IA

图6 供试品溶液色谱图

表2 中间精密度试验结果

2.2.4 稳定性试验 结果见表3。24 h内复方苦玄参颗粒供试品中苦玄参苷IA的平均含量为3.03 mg/g，RSD为0.02%。结果表明，供试品溶液在室温下24 h内稳定。

表3 稳定性试验结果

2.2.5 加样回收率试验 结果见表4。苦玄参苷IA的平均回收率为98.07%；RSD为0.01%(n=6)。结果表明，本法用于复方苦玄参颗粒中苦玄参苷IA含量测定的准确度良好。

2.2.6 样品测定 3批复方苦玄参颗粒样品(批号:20151008、20151015、20151022)含量测定结果见表5。

表4 加样回收率试验结果

表5 3批复方苦玄参颗粒样品的含量

3 讨论

3.1 关于苦玄参和桃金娘根的薄层鉴别

关于苦玄参的薄层色谱鉴定方法，本研究参照《中华人民共和国兽药典》(2015年版二部)[12]收载的药材苦玄参的薄层鉴别方法。用此方法进行复方苦玄参颗粒中苦玄参的薄层鉴别，结果分离效果较好，该法对苦玄参的鉴别符合专属性、重复性及系统适应性试验要求，可作为标准中苦玄参的鉴别方法。

关于桃金娘根的薄层色谱鉴定方法，本研究参照《湖南省中药材标准》(2010年版)[13]收载的药材桃金娘根的薄层色谱鉴定方法，并且进行了薄层色谱条件的优化，最后确定以三氯甲烷-苯-甲醇-甲酸(15∶15∶4∶2)为展开剂，进行复方苦玄参颗粒中桃金娘根的薄层鉴别，该法对桃金娘根的鉴别符合专属性、重复性及系统适应性试验要求，可作为标准中桃金娘根的鉴别方法。

3.2 高效液相色谱条件的确定

对苦玄参苷IA对照品的紫外吸收光谱(200 nm～400 nm)测定结果表明，苦玄参苷IA在264 nm附近有强吸收。为能灵敏地检出上述成分，本方法选择264 nm作为检测波长。而其他色谱条件，如流动相及其配比、柱温和流速等，本研究参照《中华人民共和国兽药典》(2015年版二部)收载的药材苦玄参的含量测定方法，并进行多次的筛选、验证，最终确定上述色谱条件。结果显示，供试品在该色谱条件下，苦玄参苷IA的峰纯度良好，未与其他峰混杂，专属性好。