黄连温胆汤含药血清改善小鼠脂肪细胞胰岛素抵抗的机制探讨

刘紫君，韩宇博，彭鹏，娄宏君，刘莉

(黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨150040)

代谢综合征(MS)是一系列能导致心脑血管疾病的代谢紊乱状态，给患者和社会带来的负担日益严重，而IR及肥胖是引起和组成MS的关键[1]。脂肪组织是体内主要能量储备系统，是胰岛素作用的关键靶点，也是糖脂代谢发生的主要场所[2]，故常用脂肪细胞模型研究糖脂代谢。黄连温胆汤是古代名方，符合MS辨证要点，本课题组前期研究证实其可明显改善MS患者的多项代谢指标，尤其对于IR的各项指标均有很好的改善[3,4]。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)是重要的胰岛素受体后信号通路之一，从胰岛素与受体结合到激活下游葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)向细胞膜移动完成葡萄糖摄取，中间经过多层的级联信号传导，该条通路中的环节发生异常可引起信号传导障碍，细胞利用葡萄糖能力下降，导致IR发生。2016年10月～2018年4月，我们以服用过黄连温胆汤的大鼠含药血清作用于小鼠脂肪细胞IR模型，观察此含药血清对脂肪细胞IR的改善情况，初步探讨相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、动物、试剂与仪器 3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞株购买于中国科学院细胞库。SPF级雄性SD大鼠30只，购买于黑龙江中医药大学实验动物中心，体质量(200±20)g，适应性饲养1周后用于实验研究。Ori Cell TMSD大鼠骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基试剂盒(赛业生物科技有限公司)；葡萄糖测定试剂盒(中生北控生物科技公司)；SYBR qPCR Mix(日本Toyobo，TYB-QPS-201)；兔Anti-IRS1抗体、兔Anti-phospho-IRS1(Tyr612)抗体、兔Anti-GLUT4抗体(博奥森)；兔Anti-PI3K p85α抗体(Abcam)；兔Anti-phospho-PI3K p85α(Tyr607)抗体(博欧特)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(Biosharp)；盐酸二甲双胍购买于天津阿尔法生物科技有限公司。倒置相差显微镜(CKX41FS，日本奥林巴斯)；酶标仪(MULTISKAN FC，Thermo)；Real time PCR仪(CFX96，Bio-Rad)。

1.2 含药血清制备

1.2.1 黄连温胆汤制备 黄连温胆汤组方为黄连10 g、清半夏15 g、竹茹15 g、枳实15 g、陈皮15 g、茯苓20 g、生姜5 g、甘草10 g，所有饮片购买于黑龙江中医药附属第一医院草药局。称取黄连温胆汤的所有中药饮片，生药量共105 g，加入14倍量的蒸馏水，煎煮3次。每次煮沸后再煎煮1 h，纱布过滤，3次药液合并，减压浓缩至稠膏状，并用冻干机做成冻干粉。用蒸馏水稀释冻干粉至生药浓度为2.1 g/mL的药液(按60 kg人与200 g大鼠体表面积等效剂量折算，终浓度相当于成人给药量的24倍)。

1.2.2 动物干预及血清制备 取15只SD大鼠，每日灌服黄连温胆汤冻干粉稀释液2次，早8时和晚20时各灌胃1次，灌胃后给予适量鼠粮，以模拟临床中汤剂早饭前、晚饭后的分服。另15只SD大鼠每日灌服等体积蒸馏水。均连续给药5 d。最后一次灌药1 h后，戊巴比妥那腹腔注射，麻醉状态下，仰卧位固定，沿腹正中线逐层打开腹腔，腹主动脉采血，3 000 r/min，离心15 min，分离上层血清，得到黄连温胆汤含药血清及空白血清，于-80 ℃存放。

1.3 脂肪细胞的诱导分化 采用经典鸡尾酒方法。取5%CO2、37 ℃培养条件下的3T3-L1细胞，待融合度达到100%将培养基换成3 mL诱导培养基A液；3 d后换成2 mL诱导培养基B液；24 h后换回A液；A液和B液更替再重复两次；用B液维持培养4～7 d。将细胞用10%甲醛固定，加入油红O染液，异丙醇清洗后显微镜下观察，95%以上呈成熟脂肪细胞表型，细胞内有明显脂滴，为脂肪细胞诱导成功[5]。

1.4 IR脂肪细胞模型制备 在分化成熟的脂肪细胞中，加入含有1 μmol/L地塞米松的增殖培养基，培养96 h后以葡萄糖消耗量明显降低，即构建为IR脂肪细胞模型，且36 h内模型稳定[6]。

1.5 黄连温胆汤最佳干预浓度及时间确定 取IR脂肪细胞，分为四个水平，每个水平设3个复孔，均培养于DMEM高糖+5%FBS培养基，分别给予高剂量中药(8%含药血清)、中剂量中药(4%含药血清+4%空白血清)、低剂量中药(2%含药血清+6%空白血清)、无中药(8%空白血清)，分别培养12、24和36 h。收集培养板各孔培养液，应用葡萄糖氧化酶法葡萄糖测定试剂盒测定培养液中葡萄糖的含量，计算葡萄糖消耗量。以葡萄糖消耗量明显升高为依据，最终确定4%含药血清为最佳干预浓度、36 h为最佳干预时间。

1.6 细胞分组及干预方法 取IR脂肪细胞，随机分为模型组、黄连温胆汤组和二甲双胍组。另取未进行IR造模的脂肪细胞作为正常组。每组各设3个复孔。各组细胞均培养于DMEM高糖+5%FBS培养基，模型组、黄连温胆汤组和二甲双胍组分别加入8%空白血清、4%含药血清+4%空白血清、盐酸二甲双胍溶液1 mmol/L，正常组加入8%空白血清。培养36 h。

1.7 PI3K-GLUT4信号通路相关基因检测 采用TRIzol法提取RNA，Real time qPCR法检测PI3K-GLUT4信号通路相关基因胰岛素受体底物1(IRS1)、PI3K-p85α亚基、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)mRNA表达。设正常组的mRNA表达量为1，测得各组的阈循环值(Ct值)，计算2-ΔΔCt，分析各基因相对mRNA表达变化。

1.8 PI3K-GLUT4信号通路相关蛋白检测 采用Western blotting法，检测IRS1、p-IRS1(Tyr612)、PI3K-p85α、p-PI3K-p85α(Tyr607)、GLUT4蛋白表达。X线胶片蛋白条带的灰度值结果使用凝胶图像处理系统进行扫描，磷酸化蛋白的灰度值与其对应蛋白的灰度值之比作为磷酸化蛋白的相对表达量，其余各组蛋白的灰度值与内参GAPDH的灰度值之比作为相应蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组脂肪细胞葡萄糖消耗量 正常组、模型组、黄连温胆汤组、二甲双胍组葡萄糖消耗量分别为(18.863±0.117)、(13.073±0.587)、(16.613±0.947)、(15.867±0.127)mmol/L，模型组葡萄糖消耗量低于正常组，黄连温胆汤组葡萄糖消耗量高于模型组(P均<0.05)。

2.2 各组PI3K-GLUT4信号通路相关基因表达比较 与正常组比较，模型组GLUT4 mRNA表达下调，黄连温胆汤组和二甲双胍组GLUT4 mRNA表达上调(P均<0.05)；与模型组比较，黄连温胆汤组和二甲双胍组GLUT4 mRNA表达上调(P均<0.01)；与二甲双胍组比较，黄连温胆汤组GLUT4 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。各组间IRS1、PI3K-p85α mRNA表达差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组PI3K-GLUT4信号通路相关基因表达比较[M(P25,P75)]

2.3 各组PI3K-GLUT4信号通路相关蛋白表达结果 与正常组比较，模型组p-IRS1(Tyr612)/IRS1、p-PI3K-p85α(Tyr607)/PI3K-p85α和GLUT4蛋白表达下调(P均<0.05)；与模型组比较，黄连温胆汤组和二甲双胍组上述三种蛋白表达水平均上调(P均<0.05)；与二甲双胍组比较，黄连温胆汤组上述三种蛋白表达差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2、图1～3。

表2 各组PI3K-GLUT4信号通路相关蛋白表达比较

图1 各组p-IRS1 (Tyr612)蛋白表达情况Western blotting法)

图2 各组p-PI3K-p85α(Tyr607)蛋白表达情况(Western blotting法)

图3 各组GLUT4蛋白表达情况(Western blotting法)

3 讨论

IR和肥胖是引起和组成MS的关键因素，控制IR和肥胖的发生进展是改善MS状态的重要途径。IR作为MS的主要发病机制，贯穿于MS全过程[7]。脂肪组织是体内最大、最重要的能量储备系统，是胰岛素作用的关键靶点，也是糖脂代谢发生的主要场所。因此，如果脂肪细胞发生对胰岛素的不敏感甚至抵抗，必然会大幅影响糖脂代谢，其结果就是导致葡萄糖摄取利用减少，葡萄糖堆积剩余[2]。IR与肥胖又互相影响，众多研究表明，胰岛素敏感与否是影响肥胖的重要因素[8]。3T3-L1脂肪细胞由3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞诱导分化而来，当细胞从快速分裂到长满且接触抑制时，该细胞系会从前脂肪细胞向脂肪样细胞逆转，是常用于建立成熟脂肪细胞模型的细胞系之一。本研究使用3T3-L1脂肪细胞IR模型进行研究，更能代表体内胰岛素调节糖脂代谢的进程，模拟MS关键因素的糖脂代谢状态。本研究发现，模型组葡萄糖消耗量低于正常组，说明胰岛素抵抗模型建立成功。

胰岛素与受体结合后将激活胰岛素受体后信号通路，PI3K/Akt是其中重要的一条通路。经过多层的级联信号传导，激活下游GLUT4向细胞膜移动完成葡萄糖摄取。如果信号通路受到影响，会导致细胞利用葡萄糖能力下降，进而产生IR，最终导致MS的发生。IRS是PI3K/Akt信号通路上游的重要部分，IRS1是其最主要的异构体[9]，而p-IRS1(Tyr612)则是IRS1的612位点酪氨酸磷酸化的形式，可以理解为是它的活性形式，通过这种活性形式可以将胰岛素的信号继续传导进入下游通路，所以p-IRS1(Tyr612)占IRS1的比例反映了有效参与传导胰岛素信号的通路蛋白的多少。PI3K由调节亚基p85和催化亚基p110组成[10]，调节亚基p85的表达直接参与糖脂代谢[11]，p-PI3K-p85α(Tyr607)是其607位点酪氨酸磷酸化的形式，p-PI3K-p85α(Tyr607)占PI3K-p85α的比例也反映了传导胰岛素信号的效率。本研究发现，IRS1和PI3K-p85α mRNA水平的表达在黄连温胆汤含药血清处理后并未有明显改变，说明含药血清调节IR可能不是从转录水平进行的。然而，IRS1的Tyr612位点磷酸化蛋白相对IRS1总蛋白表达水平存在差异，与正常组比较，模型组p-IRS1(Tyr612)/IRS1蛋白表达量下调，表明IR-3T3-L1脂肪细胞IRS1的酪氨酸磷酸化减少；黄连温胆汤组此比值较模型组增多，表明黄连温胆汤可促进IRS1磷酸化，提高胰岛素信号传导的效率。此外，PI3K-p85α的酪氨酸607(Tyr607)位点磷酸化蛋白相对PI3K-p85α总蛋白表达水平也存在差异，模型组p-PI3K-p85α(Tyr607)/PI3K-p85α下调，表明IR脂肪细胞PI3K-p85α的酪氨酸磷酸化减少，引起胰岛素信号传导障碍。经黄连温胆汤或二甲双胍干预，此比值较模型组上调，表明PI3K是黄连温胆汤改善IR的靶点之一。

同时我们也检测了此信号通路下游的GLUT4的表达情况，与正常组比较，模型组脂肪细胞GLUT4 mRNA表达下调，同时模型组GLUT4蛋白的表达量也较正常组下降，应用黄连温胆汤或二甲双胍干预后，GLUT4 mRNA及蛋白的表达量被上调，表明黄连温胆汤可上调GLUT4基因表达水平，增强PI3K和GLUT4之间的胰岛素信号转导，改善脂肪细胞IR程度。

黄连温胆汤是古代名方，出自清代陆廷珍所著《六因条辨》，诸药合用共奏清热燥湿、健脾化痰和胃之功，主治胆胃不和，痰热内扰证之心烦、失眠、胸闷、头身困重、呕恶口苦、苔黄腻、脉滑数等。符合MS辨证要点，用之临证治疗MS，可改善各代谢组分疗效显著且毒副作用小，能发挥中医药多途径、多靶点的整体调节优势。前期基础研究表明，黄连温胆汤可降低饮食诱导MS大鼠血压、血糖、体质量、血脂水平，综合改善MS各代谢组分[3,12～14]。

在中药复方的体外药理作用研究中，直接用药物进行实验难以确定发挥药效的主要成分，因中药复方成分众多，但只有通过首关消除后，吸收入血的成分才能继续发挥药效，成为药效物质的基础(不通过首关消除的药物除外)，因此口服中药血清中含有的原型成分、代谢产物、与机体作用形成的新成分，才可能是真正的有效成分。而且离体反应系统无法替代真实的体内环境，经过复杂的体内吸收代谢过程，一些原药成分可能会发生理化变化[15]。故本实验采用含药血清方法来代表药物体内过程，以进一步进行认定、分离体内移性成分，从体内直接作用化学成分的角度确定黄连温胆汤改善IR的药效物质基础[16]。本研究发现，黄连温胆汤组葡萄糖消耗量高于模型组，提示含药血清确能显著增加脂肪细胞的葡萄糖消耗量，表明黄连温胆汤血清对IR有明显的改善作用；经黄连温胆汤含药血清干预后， PI3K、IRS和GLUT4的蛋白活性部分均较模型组增高，且GLUT4 mRNA表达水平也较模型组上调，说明黄连温胆汤改善IR是通过PI3K-GLUT4信号通路进行的。

综上所述，黄连温胆汤含药血清可有效改善鼠脂肪细胞的IR，其机制可能是通过PI3K-GLUT4信号通路实现的。