hsa-miR-34b-3p与CDK4在骨肉瘤组织中的表达水平及临床意义

宋光泽 赵慧霞

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤[1]。研究证明许多miRNA在骨肉瘤中的抗转移作用[2]。hsa-miR-34(miR-34)家族成员是肿瘤抑制蛋白p53的直接转录靶点，通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡和细胞周期阻滞在几种类型的癌症中起抑制肿瘤的作用[3]。细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK4)是TargetScan预测的miR-34b靶基因之一。CDK4是蛋白激酶复合物的催化亚基，对于细胞周期G1期进展十分重要。然而，关于在骨肉瘤患者中miR-34b对CDK4的调控作用及相关临床意义尚未研究。本研究旨在探究hsa-miR-34b-3p(miR-34b)与CDK4在骨肉瘤中表达水平及临床意义。

1 材料与方法

1.1 患者资料及样本收集

选取我院2012年3月至2016年3月病理科骨肉瘤患者外检档案中100例冻存骨肉瘤组织及其对应的癌旁组织标本，其中男性与女性病例各50例，年龄8～70岁，平均(17±7)岁，病程1～24个月，平均(5±1.5)个月。其中软组织浸润67例，软组织无浸润33例，肿瘤转移58例，无转移42例。Enneking外科诊断分期：Ⅰ期病例21例，Ⅱa期病例24例，Ⅱb期病例26例，Ⅲ期病例29例。

1.2 方法

1.2.1 MicroRNA、mRNA提取及荧光定量实时PCR(Quantitative realtime-PCR，qRT-PCR) 使用qRT-PCR检测组织中hsa-miR-miR-34b-3p(miR-34b)表达水平。使用TRIzol试剂(Invitrogen)从组织提取总RNA。使用Reverse Transcription Kit(Takara)将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green(Takara)进行实时PCR分析。利用ABI7500系统(Applied Biosystems)进行qRT-PCR反应。以U6作为内参。用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。qRT-PCR反应条件: 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40个循环。

1.2.2 蛋白免疫印迹(Western Blot，WB)分析 使用WB检测CDK4蛋白的表达水平。使用RIPA蛋白提取试剂(Beyotime)裂解组织，从组织中提取蛋白质。在4 ℃下12 000×g离心10 min后，通过10%SDS-PAGE分离上清液，将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜(Sigma)上。将膜在PBS和5%脱脂乳中封闭1 h，并用针对CDK4的一抗(cell signaling technology)将膜在4 ℃孵育过夜。将膜用HRP缀合的二抗(cell signaling technology)在室温下孵育1 h。β-actin蛋白表达作为内参。使用Quantity One软件(life technologies)评估相对蛋白表达水平。

1.3 数据分析

2 结果

2.1 miR-34b和CDK4蛋白在骨肉瘤组织样本及癌旁非肿瘤组织中的表达情况

与癌旁非肿瘤组织相比，骨肉瘤组织中miR-34b的表达水平显著降低，而CDK4蛋白的表达水平显著增高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 骨肉瘤组织样本及癌旁非肿瘤组织中miR-34b和CDK4蛋白的表达情况

注：与非肿瘤组织相比，*为P<0.05。

2.2 miR-34b和CDK4 蛋白在骨肉瘤组织样本中的表达情况及相关性分析

在骨肉瘤患者的组织样本中检测到miR-34b和CDK4蛋白的表达，如图1所示。在骨肉瘤组织中，miR-34b的表达随肿瘤临床分期进展而逐渐降低(图1A)，而CDK4蛋白的表达逐渐增高(图1B)。通过分析骨肉瘤组织中miR-34b表达变化与CDK4 蛋白表达变化的相关性，结果发现，随着miR-34b表达水平的降低，CDK4 蛋白表达呈上升趋势，miR-34b表达与CDK4 蛋白表达呈负相关，见图1C。

图1 miR-34b和CDK4 蛋白在骨肉瘤组织样本中的表达及相关性分析

2.3 骨肉癌组织中miR-34b、CDK4蛋白表达与临床分期的关系

在骨肉瘤不同临床分期中，miR-34b和CDK4蛋白表达水平不同(P均<0.05)。随着临床分期的进展，miR-34b表达呈上升趋势，而CDK4 蛋白表达呈下降趋势，见表2。

表2 骨肉癌组织中miR-34b和CDK4蛋白表达与临床分期的关系

注：与Ⅰ期相比，①为P<0.05；与Ⅱa期相比，②为P<0.05；与Ⅱb期相比，③为P<0.05。

2.4 骨肉癌组织中miR-34b和CDK4蛋白表达与临床指标的关系

在软组织浸润和转移病例中miR-34b的表达水平，显著低于软组织无浸润和无转移病例，差异具有统计学意义(P<0.05)，而CDK4蛋白表达显著增高(P<0.05)，见表3。

表3 骨肉癌组织中miR-34b和CDK4蛋白表达与临床指标的关系

注：与无浸润组相比，*为P<0.05；与无转移组相比，#为P<0.05。

3 讨论

骨肉瘤的发生、发展过程与多种致癌基因及抑癌基因的表达相关。致癌基因和抑制基因表达异常通过调控细胞增殖、迁移参与肿瘤发生、发展过程。

MiRNA是长21-25nt的非编码RNA分子，其通过靶向结合mRNA的3'非翻译区(3'UTR)来抑制转录和转录后水平的基因表达。MiRNA可结合mRNA的部分互补识别序列，随后引起mRNA降解可翻译抑制，从而有效沉默其靶基因[4-6]。生物信息学研究表明，三分之一的已知基因可能被miRNA调控。许多研究已报道miRNA参与许多重要的细胞过程，如细胞凋亡、分化、增殖、肿瘤发生及抑制等[7]。证据表明，miRNA突变或表达异常与各种人类癌症相关。miRNA通过调节其他肿瘤抑制因子或致癌基因表达而起癌基因或抑癌基因的作用[8]。在癌症中，miRNA调节异常是影响下游靶点，并进一步影响致瘤性发生如增殖、转移和凋亡的常见特征[9]。因此，miRNA在肿瘤组织中的表达可作为诊断和预后评估的新靶点。

MiR34家族由位于染色体1(miR-34a)和染色体11(miR-34b/c)的3个同源miRNA组成，神经母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌中检测到miR34的缺失。miR-34家族成员由p53在DNA损伤或致癌应激反应中直接诱导而表达[10]。研究发现，miR-34在许多恶性肿瘤中表达降低，如前列腺癌中的miR-34c、结肠癌和肺癌中的miR-34a和-34c、神经母细胞瘤中的miR-34a、乳腺癌中的miR-34a和-34b[11-14]。miR34a通过抑制CD44蛋白的表达来抑制骨肉瘤细胞在体内和体外的转移[15]。miR34c通过靶向调控Notch1和LEF1而抑制骨肉瘤细胞迁移，且miR34c表达的增加对克服骨肉瘤细胞化疗耐药性具有重要意义[16]。miR34b与三阴性乳腺癌(TNBC)患者的生存率呈负相关，可作为TNBC的预后生物标志物[17]。在骨肉瘤细胞系中，miR-34s影响CDK6、E2F3、Bcl-2的表达，并以p53依赖的方式部分诱导G1期停滞和细胞凋亡，且在骨肉瘤组织样本中检测到miR-34s表达的降低[18]。miR-34在癌症中的表达下调表明miR-34家族作为肿瘤抑制基因，可作为癌症预后潜在标志物。然而，miR-34b在骨肉瘤中的表达情况与骨肉瘤临床病理特征之间关系的研究鲜有报道。本研究采用qRT-PCR技术分析了100例骨肉瘤组织中miR-34b的表达情况，并分析其临床意义。结果发现，miR-34b在骨肉瘤组织中的表达显著低于癌旁非肿瘤组织，且随着临床分期的进展，其表达逐渐降低，且在软组织浸润与转移病例中，miR-34b的表达显著下降。提示，miR-34b表达异常与骨肉瘤病情进展密切相关。

细胞周期调控异常与肿瘤的发生、发展密切相关。CDK4是与细胞周期调控过程G1/S期密切相关的基因，推动细胞周期进程。CDK4及其调节亚基cyclinD1是致癌基因，研究显示，这两种基因在多种常见人类癌症中表现出异常扩增[19]。此外cyclinD1-CDK4复合物的形成及激活是几种肿瘤类型形成所必需的,其中CDK4亚基催化功能至关重要[20]。CDK4过度活化是人类癌症的常见标志[21]。本研究中发现，骨肉瘤组织中CDK4蛋白表达显著增加，且随着临床分期的进展逐渐增加，在软组织浸润与转移病例中的表达也显著增加。

近年来的研究发现，CDK4受到多种miRNA的调节，而参与肿瘤的发生、发展过程。研究表明，在膀胱癌细胞系中，miR-124直接靶向调控CDK4的表达而抑制肿瘤细胞的生长[22]。MiR-613通过靶向CDK4诱导细胞周期停滞而抑制小细胞肺癌细胞的活性及肿瘤形成[23]。CDK4是TargetScan预测的miR-34b靶基因之一。miR-34b对CDK4的调控作用在骨肉瘤中的研究及相关临床意义尚未见报道。本研究中，通过分析骨肉瘤组织中miR-34b表达变化与CDK4 蛋白表达变化的相关性发现，随着miR-34b表达的降低，CDK4 蛋白表达呈上升趋势，即miR-34b表达与CDK4 蛋白表达呈负相关，提示，在骨肉瘤中，miR-34b至少部分通过影响CDK4 蛋白表达而在骨肉瘤的发生发展及病情演变过程中起作用。

综上所述，在骨肉瘤组织中，miR-34b的表达随临床分期进展而逐渐降低，而CDK4蛋白的表达逐渐增加，miR-34b表达与CDK4 蛋白表达呈负相关，推测miR-34b与CDK4是恶性肿瘤发生发展过程中的重要分子机制。然而关于miR-34b对CDK4调控相关的分子机制，及其与骨肉瘤不良预后的关系，还需进一步深入探究，以期为骨肉瘤的诊断、治疗及预后提供新的靶点。